人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA的克隆与表达

溶酶体α-甘露糖苷酶是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,该酶缺陷引起溶酶体α-甘露糖苷贮积症.用RT-PCR法从HeLa细胞中克隆的人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA含有1个由2964bp组成的阅读框,编码由988个氨基酸组成的多肽,前26个氨基酸为潜在的前导序列,成熟多肽的预测分子量为111kD,具有11个潜在的N-交联糖基化部位.用逆转录病毒介导法导入患者细胞后,该cDNA表达高活性α-甘露糖苷酶.序列分析表明,此cDNA与已发表的拟似人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA有不同程度的差异。

山羊溶酶体α-甘露糖苷酶不同结构域片段的制备及酶活性的鉴定

为分析溶酶体α-甘露糖苷酶(lysosomalα-mannosidase,LAM)亚基结构与酶活性的关系,分别截短、扩增含有山羊溶酶体α-甘露糖苷酶(Capra hircas LAM,ChLAM)高度保守活性位点的亚基片段ChA、ChC、ChD和ChT,将其作为目的基因构建酵母表达载体pPIC9K-ChA、pPIC9K-ChC、pPIC9K-ChD和pPIC9K-ChT,线性化后电转至酵母GS115感受态细胞,以1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,并对表达产物进行LAM活性检测。结果显示,毕赤酵母中成功表达了有活性的ChLAMt蛋白,相对分子质量约为90 kDa,活性为35 U;而ChA、ChC、ChD表达产物不具有酶的活性。ChLAMt酶活性最适温度为45~55℃,最适pH5.5,Zn^(2+)和Ca^(2+)对ChLAMt酶活性有促进作用,ChLAMt蛋白与野生型全长编码的ChLAM蛋白有相似的酶活特性,说明A、C、D这3个亚基上高度保守的活性位点共同参与酶的催化反应,为ChLAM的研究提供了资料。

N-聚糖合成通路中内质网α-1,2甘露糖苷酶和α-甘露糖苷酶Ⅱ基因对家蚕胚胎滞育的调控作用

家蚕滞育是基因与环境协同作用的结果,其调控网络十分复杂,至今仍未完全阐明。为了解家蚕N-聚糖生物合成通路是否参与胚胎滞育调控,调查家蚕不同化性品系蛹期、胚胎发育早期以及滞育激素(DH)、蜕皮激素(20E)处理后BmN细胞中内质网α-1,2甘露糖苷酶基因(BmMAN1B)和α-甘露糖苷酶Ⅱ基因(BmMAN2)的转录水平。qRT-PCR结果显示:这2个基因在不同化性品系中的转录水平存在较大差异,蛹晚期的转录水平高于早期;分别用100 nmol/L DH和10 ng/mL 20E处理BmN细胞,BmMAN1B和BmMAN2的转录水平都极显著上调,提示2个基因与家蚕滞育密切相关。对BmN细胞和家蚕二化性品系秋丰165℃催青产非滞育卵组(QFLT)蛹期2 d雌蛹进行BmMAN1B和BmMAN2基因的RNA干扰,结果发现滞育相关基因BmDH、BmDHR-1、BmTRE2和BmSDH-2a等的转录水平发生了变化;当在个体水平进行BmMAN1B和BmMAN2基因的共同干扰时,382%的子代卵由非滞育转变为滞育。结果表明,BmMAN1B和BmMAN2在家蚕胚胎滞育中具有重要的调控作用。

α-甘露糖苷酶研究进展

α-甘露糖苷酶多具有糖苷水解酶38、47家族保守序列,目前已测序的α-甘露糖苷酶基因序列超过2000多种,根据α-甘露糖苷酶基因保守序列可将其分为三类,即Ⅰ类α-甘露糖苷酶、Ⅱ类α-甘露糖苷酶和未分类α-甘露糖苷酶。α-甘露糖苷酶主要参与蛋白质糖基化修饰和糖蛋白聚糖水解修饰。其代谢异常可以引起多种疾病,目前研究较多的是由α-甘露糖苷酶功能障碍引起的先天性红细胞生成异常性贫血Ⅱ型和α-甘露糖苷贮积症。论文主要对α-甘露糖苷酶的分类及其在糖基化过程中的作用,以及与之有关的疾病进行介绍,以期为苦马豆素毒性作用机制研究提供理论参考。

地衣芽孢杆菌NK-27菌株β-甘露糖苷酶的产酶条件及粗酶性质

地衣芽孢杆菌 NK-2 7菌株可以产生胞外β-甘露聚糖酶和胞内β-甘露糖苷酶 .β-甘露糖苷酶活力主要集中于细胞匀浆液中 .以 2 .0 %魔芋粉、1 .0 % ( NH4) 2 SO4为碳、氮源地衣芽孢杆菌 NK-2 7菌株经 30℃振荡培养 2 0～2 4 h产生 β-甘露糖苷酶酶活力最高 .该酶于 30～ 4 0℃、p H6 .0时酶活力最高 ,在 30～ 4 0℃、p H5 .4～ 7.

高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ在胃癌中的表达及其与E-cadherin、Galectin-3的关系

目的:探讨胃癌高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)、E-cadherin、Galectin-3的表达及其与胃癌发生发展的关系。方法:应用免疫组化SP法检测65例胃癌,20例正常胃黏膜组织中GMⅡ、E-cadherin、Galectin-3的表达情况。结果:65例胃癌中GMⅡ、E-cadherin、Galectin-3的阳性表达率分别为85%(55/65)、40%(26/65)、74%(48/65)。20例胃正常切缘中GMⅡ、E-cadherin、Galectin-3的阳性表达率分别为50%(10/20)、100%(20/20)、40%(8/20)。GMⅡ、Galectin-3在浸润程度深及有淋巴结转移的胃癌组织中表达明显高于浸润程度浅及无淋巴结转移的胃癌组织(P<0.05)。而E-cadherin则在分化程度低,浸润程度深及有淋巴结转移的胃癌组织中表达明显低于分化程度高,浸润程度浅及无淋巴结转移的胃癌组织(P<0.05)。统计学分析GMⅡ与E-cadherin之间呈负相关(P<0.05),与Galectin-3无相关性(P>0.05)。结论:GMⅡ、Galectin-3在胃癌中高表达,且与癌组织的浸润和转移明显相关。同时GMⅡ与E-cadherin呈负相关,提示GMⅡ可能通过下调E-cadherin的表达来促进胃癌的发展。

6A8α-甘露糖苷酶表达减弱和表达正常鼻咽癌细胞间的差异基因表达

目的发现因转导反义6A8cDNA致恶性生物学行为减弱的人鼻咽癌细胞CNE-2L2(AS)和野生型细胞(W)间的差异表达基因。方法用DNA微列阵方法比较AS细胞和W细胞基因表达的差异。用Northern印迹和RT-PCR验证所得结果的可靠性。结果与W细胞相比,AS细胞有34个基因的表达上调,有42个基因的表达下调。其表达增强可能对肿瘤恶性行为有抑制作用的基因有P130mRNAfor130Kprotein、TGF-betaIIRalpha、GABBR1、TGFBR1、TNFAIP1、STANIN、E-CADHERIN、CTNNA1、CTNNA2、RFX2及TMPO等,其表达减弱可能对肿瘤恶性行为有抑制作用的基因有CD44、NDRG1、TGFB1、RPS5、LEGUMAI、CBS、CD59及SNRPA1等。Northern印迹和RT-PCR验证了DNA微列阵方法检测的结果。结论与W细胞相比,AS细胞有34个基因表达上调,有42个基因表达下调,某些基因表达的改变可能与AS细胞恶性生物学行为的减弱相关。

苦马豆素抑制α-甘露糖苷酶的剂量效应关系

根据苦马豆素(Sw)抑制α-甘露糖苷酶(AMA)的特点,建立了SW抑制AMA的剂量效应关系曲线和酶法测定SW溶液浓度的方法。SW溶液浓度范围在5×10-8mol/L^5×10-6mol/L时,SW溶液浓度的负对数与其抑制AMA活性百分比呈线性关系,线性方程Y=0.026X+5.167 4,R2=0.994 7。建立了酶法测定SW溶液浓度的方法,为疯草的进一步研究提供技术支持。

小花棘豆中毒对大鼠睾丸α-甘露糖苷酶的影响

旨在探讨小花棘豆对大鼠睾丸α-甘露糖苷酶(AMA)的影响,揭示小花棘豆的毒性作用机理。将72只大鼠随机分为4组,即对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。将小花棘豆全草粉碎后,按Ⅰ组添加150g/kg(含苦马豆素30mg/kg)、Ⅱ组添加300g/kg(含苦马豆素60mg/kg)、Ⅲ组添加450g/kg(含苦马豆素90mg/kg)的比例制作混合饲料,饲喂至典型临床症状出现为止。攻毒后每7d每组随机采集2只大鼠的睾丸,检测大鼠睾丸AMA活性及表达的变化。结果显示,在63d的试验过程中,试验组及对照组大鼠睾丸高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶体α-甘露糖苷酶(AMA2)均有表达,但各试验组表达转录水平与对照组差异显著,试验Ⅰ组大鼠AMA1和AMA2的表达与对照组差异不显著(P>0.05),但试验Ⅲ组大鼠AMA1和AMA2的表达均显著低于对照,随着试验的进行,抑制效果愈加明显。说明,小花棘豆中毒可影响大鼠睾丸AMA的活性及其基因的转录表达。

小花棘豆中毒对和田羊丘脑-垂体-性腺轴α-甘露糖苷酶的影响

探讨小花棘豆中毒对和田羊丘脑-垂体-性腺轴α-甘露糖苷酶(AMA)的影响,进一步揭示小花棘豆的毒性作用机理。将12只和田羊随机分为3组,即对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。试验组分别按10 g/kg和20 g/kg的剂量饲喂小花棘豆,饲喂至典型中毒症状出现为止。屠宰后每组随机采集试验羊的丘脑、垂体和性腺,检测和田羊丘脑-垂体-性腺轴AMA活性及表达的变化。结果表明:和田羊丘脑-垂体-性腺轴高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶体α-甘露糖苷酶(AMA2)均有表达,但各试验组表达转录水平与对照组差异显著,试验Ⅰ组与试验Ⅱ组和田羊丘脑-垂体-性腺轴的AMA2的表达均与对照组差异不显著(P﹥0.05),试验Ⅱ组和田羊丘脑-垂体-性腺轴AMA1的表达极显著低于对照(P﹤0.01)。结果显示,小花棘豆中毒可影响和田羊丘脑-垂体-性腺轴AMA的活性及其基因的转录表达。

6A8α-甘露糖苷酶酶解p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside

目的明确6A8cDNA编码蛋白质的α-甘露糖苷酶性质。方法利用基因重组技术将克隆到的3个DNA片段拼接成完整6A8cDNA将其插入到真核表达载体pCDI转染COS-7细胞,用酶活性检测与Westernblot对瞬时表达的蛋白质的性质进行鉴定。结果拼接后的cDNA片段经测序完全符合6A8cDNA碱基顺序。转染重组表达载体pCDI-6A8的COS-7细胞的匀浆对p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside的酶解作用为转染空载体pCDI的细胞及野生型细胞的3～4倍,且这种酶解作用不能被swainsonine所抑制。Westernblot检测显示在相对分子质量(Mr)120000处有一明显蛋白带,此带的显影于转染pCDI-6A8cDNA的细胞明显深于转染空载pCDI及野生型细胞。结论6A8cDNA编码的蛋白质确为一种α-甘露糖苷酶,属于Ⅱ类α-甘露糖苷酶。

6A8 cDNA编码一种α-甘露糖苷酶

目的 探讨6A8cDNA编码的蛋白质的性质。方法 依据ConA的配体是甘露糖,而α-甘露糖苷酶的作用是修剪细胞糖蛋白聚糖中甘露糖的原理,采用细胞免疫荧光染色法以及激光共聚焦显微镜观察经转染6A8cDNA正义或反义重组表达载体后,细胞结合ConA的强弱,验证6A8cDNA编码的蛋白质是否为一种α-甘露糖苷酶。结果 COS-7细胞和人鼻咽癌细胞株CNE-2L2转染pRc/CMV-正义6A8cDNA后与ConA结合减弱,而与单抗6A8染色增强;CNE-2L2细胞转染pRc/CMV-反义6A8cDNA后,与ConA结合增强,而与单抗6A8染色减弱。结论 6A8cDNA编码的蛋白质可能为一种α-甘露糖苷酶,它可被单抗6A8识别。

小花棘豆苦马豆素对小白鼠肝脏α-甘露糖苷酶基因相对表达的影响

本试验旨在研究不同剂量苦马豆素(SW)胃内灌服小白鼠,检测其对肝脏α-甘露糖苷酶(AMA)基因在不同时间转录表达的影响。采用动物组织总RNA试剂盒提取肝脏组织总RNA,酶标仪法测定RNA纯度,凝胶电泳检测RNA完整性,实时荧光定量PCR技术检测AMA基因的转录表达水平。结果显示,试验组及对照组AMA基因均有表达,但各试验组中转录表达水平不同,与对照组相比,低剂量SW能促进肝脏AMA基因的表达,且随着试验的进行促进效果更加明显,高剂量和中等剂量SW初期也能提高AMA基因的相对表达,长时间却能严重抑制AMA基因的表达,随着试验的进行抑制效果愈明显。结果表明,不同剂量SW能在不同时间、不同程度地影响小白鼠肝脏AMA基因的转录表达。

耐贮性不同桃果实采后软化过程中α-甘露糖苷酶活性变化

以较耐贮藏桃品种"秦王"和不耐贮藏桃品种"白丽"为试材,研究采后贮藏期间果实硬度、乙烯释放速率及α-甘露糖苷酶(α-man)活性的变化差异。结果表明,耐贮性较差的"白丽"果实在贮藏的第2天其乙烯释放和α-man活性便出现小高峰,此后在贮藏第4天出现乙烯释放峰值,到贮藏第5天伴随着α-man活性的迅速升高,果实硬度快速下降。耐贮藏的"秦王"果实乙烯释放和α-man活性峰值均出现在贮藏后第5天,然后下降,在贮藏末期又出现第2个峰值。此外,在整个贮藏期间,耐贮性较差的"白丽"果实α-man活性明显高于"秦王",在贮藏后期尤为显著。说明α-man活性高低可能显著影响桃果实的耐贮性。

小花棘豆中毒对和田羊脑组织α-甘露糖苷酶的影响

探讨小花棘豆中毒对和田羊脑组织α-甘露糖苷酶(AMA)的影响,进一步揭示小花棘豆的毒性作用机理。将12只和田羊随机分为3组,即对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。试验组每日分别按每千克体质量10 g和20 g的剂量饲喂小花棘豆,饲喂至典型中毒症状出现为止。试验第35天屠宰后每组采集试验羊的全脑,检测和田羊不同脑区AMA活性及表达的变化。结果显示和田羊脑组织中高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶体α-甘露糖苷酶(AMA2)均有表达,但各试验组表达转录水平与对照组差异显著,试验Ⅰ组和田羊各脑区的AMA2的表达均与对照组差异不显著(P>0.05),试验Ⅱ组和田羊小脑AMA2的表达显著低于对照(P<0.05),其余脑区AMA2的表达均与对照组差异不显著(P>0.05);试验Ⅱ组和田羊小脑和丘脑AMA1的表达极显著低于对照(P<0.01),大脑AMA1的表达显著低于对照(P﹤0.05);试验Ⅰ组和田羊小脑AMA1的表达显著低于对照(P<0.05),其余脑区AMA1的表达均与对照组差异不显著(P>0.05)。结果表明不同剂量小花棘豆均可降低和田羊脑组织AMA活性及其mRNA表达量,小脑、大脑和丘脑是其主要作用的靶区,小花棘豆毒性成分可通过影响AMA活性导致和田羊发生中毒反应。

小花棘豆中毒对家兔卵巢α-甘露糖苷酶的影响

为了探讨小花棘豆对家兔卵巢α-甘露糖苷酶(AMA)的影响,进一步揭示小花棘豆的毒性作用机理。将24只雌性家兔随机分为4组,即对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。将小花棘豆全草粉碎后,按Ⅰ组添加15%(含苦马豆素30 mg/kg)、Ⅱ组添加30%(含苦马豆素60 mg/kg)、Ⅲ组添加45%(含苦马豆素90 mg/kg)的比例制作混合饲料,饲喂至典型临床症状出现为止。攻毒后第14、35、70天每次每组随机采集2只家兔的卵巢,检测家兔卵巢AMA活性及表达的变化。试验组及对照组家兔卵巢高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶体α-甘露糖苷酶(AMA2)均有表达,但各试验组表达转录水平与对照组差异显著,试验Ⅰ组家兔AMA1、AMA2以及试验Ⅱ组AMA2的表达与对照组差异不显著(P﹥0.05),试验Ⅱ组AMA1以及试验Ⅲ组家兔AMA1、AMA2的表达均显著低于对照(P﹤0.05),第70天时试验Ⅲ组家兔AMA1活性和表达均极显著低于对照(P﹤0.01)。小花棘豆中毒可影响家兔卵巢AMA的活性及其基因的转录表达。

一种新型α-甘露糖苷酶的异源表达及酶学性质表征

从一株性能优良的黄原胶降解菌Microbacteriumsp.XT11中克隆出α-甘露糖苷酶的编码基因MiMan。该基因大小为3 042bp,编码理论分子质量为112.4ku的蛋白质,该酶204~1 006aa为糖苷水解酶GH38家族催化域。融合His亲和纯化标签的MiMan能够在大肠杆菌中高水平可溶性表达,纯化回收率达8.96%。酶学性质分析结果表明,该酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为7.0。该酶在碱性环境具有很强的耐受力,能够耐受的最高pH达12.0。

小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴α-甘露糖苷酶的影响

【目的】探讨小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴α-甘露糖苷酶(AMA)的影响,揭示小花棘豆的毒性作用机理。【方法】将24只家兔随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,对照组饲喂青干草,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂添加15%,30%和45%小花棘豆全草的混合饲料(其苦马豆素含量分别为30,60和90mg/kg),分别于攻毒后第14,35和70天时每组随机采集2只家兔的丘脑、垂体和性腺,检测AMA在家兔丘脑-垂体-性腺轴中的分布、活性及其基因mRNA的表达量。【结果】AMA在家兔丘脑、垂体和性腺中均有分布,小花棘豆中毒可导致家兔丘脑-垂体-性腺轴AMA活性和分布明显下降。试验组及对照组家兔丘脑-垂体-性腺轴高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶体α-甘露糖苷酶(AMA2)均有表达,但各试验组表达转录水平总体低于对照组,攻毒第70天时试验Ⅰ组家兔丘脑-垂体-性腺轴的AMA1和AMA2,试验Ⅱ组家兔丘脑-垂体-性腺轴及试验Ⅲ组家兔丘脑和垂体中AMA2的表达均与对照组差异不显著(P>0.05);试验Ⅲ组家兔丘脑-垂体-性腺轴和试验Ⅱ组家兔丘脑、垂体、睾丸中AMA1mRNA表达量均极显著低于对照组(P<0.01),试验Ⅱ组卵巢AMA1mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05),试验Ⅲ组家兔睾丸和卵巢AMA2mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)。【结论】小花棘豆中毒可影响家兔丘脑-垂体-性腺轴AMA的活性及其基因的转录表达。

小花棘豆中毒对家兔脑组织α-甘露糖苷酶的影响

探讨小花棘豆对家兔脑组织α-甘露糖苷酶(AMA)的影响,进一步揭示小花棘豆的毒性作用机理。将24只家兔随机分为4组,即对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。将小花棘豆全草粉碎后,按试验Ⅰ组添加15%,试验Ⅱ组添加30%,试验Ⅲ组添加45%的比例制作混合饲料,饲喂至典型临床症状出现为止。攻毒后第14、35、70 d每次每组随机采集2只家兔的全脑,检测家兔不同脑区AMA活性及表达的变化。结果显示,小花棘豆中毒可不同程度地导致家兔脑组织AMA活性和表达下降,从第14d起,所有试验组小脑AMA活性及mRNA表达量均显著低于对照组(P﹤0.05),试验Ⅲ组家兔大脑和丘脑AMA活性及mRNA表达量均显著低于对照组(P﹤0.05),但3个试验组海马和脑干AMA活性及mRNA表达量与对照差异均不显著(P﹥0.05)。结果表明,不同剂量小花棘豆均可降低家兔脑组织AMA活性及其mRNA表达量,小脑、大脑和丘脑是其主要作用的靶区,而且小脑的变化较大脑和丘脑明显。

海栖热袍菌耐高温β-甘露糖苷酶基因的克隆及表达

以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8基因组DNA为模板,克隆得到β-甘露糖苷酶基因(man2).测序分析表明,该基因全序列为2358bp,编码785个氨基酸,分子量约为92×103.根据蛋白质氨基酸的同源性分析,该β-甘露糖苷酶与新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)Man2(accession No.AAK52304.1)的同源性最大,达到80%.将此基因连接至表达载体pET-28a(+)并转化到大肠杆菌BL21细胞中,经IPTG诱导,β-甘露糖苷酶活力达5.96U/mL.粗酶的温度稳定性分析表明,该酶的热稳定性好,90℃处理10min,活力回收率65%,具有重要的工业应用前景.