溶酶体组织蛋白酶B增加自噬保护缺氧诱导的心脏微血管内皮细胞损伤

目的探讨CTSB是否参与缺氧诱导的心脏微血管内皮细胞损伤。方法采用缺氧诱导内皮细胞损伤模型;分离CTSB基因敲除小鼠心脏微血管内皮细胞,采用腺病毒过表达CTSB,采用巴弗洛霉素阻断细胞自噬;采用ELISA法检测炎症因子的释放水平;采用TUNEL染色法检测细胞凋亡数量;采用caspase-3试剂盒检测细胞caspase-3的活性;细胞感染LC3-GFP-mCherry双标病毒,检测细胞自噬流的水平。结果CTSB基因敲除可明显加重缺氧诱导的内皮细胞炎症、凋亡,增加细胞自噬。CTSB过表达可减轻缺氧诱导的内皮细胞炎症、凋亡,增加细胞自噬。但是巴弗洛霉素处理可明显抵消CTSB过表达对细胞炎症、凋亡的抑制作用和对细胞自噬的保护作用。结论 CTSB基因敲除加重缺氧诱导的内皮细胞炎症和凋亡,而CTSB基因过表达减轻缺氧诱导的内皮细胞损伤。CTSB通过维持内皮细胞正常的自噬降解发挥作用。

溶酶体组织蛋白酶L对人卵巢癌SKOV3细胞迁移及侵袭的作用

目的探讨溶酶体组织蛋白酶L(Cathepsin L)是否通过上皮-间充质转化(EMT)影响卵巢癌细胞的侵袭及迁移能力。方法荧光定量PCR法检测人卵巢癌细胞ES-2、SKOV3、OV1以及OV2中Cathepsin L的表达水平;设计并合成靶向Cathepsin L的特异性sh RNA,通过脂质体转染法转染Cathepsin L表达最高的卵巢癌细胞SKOV3以构建稳定低表达Cathepsin L细胞株,Western blot和定量PCR法验证sh RNA的干扰效率;划痕实验及Transwell法检测干扰后细胞的迁移及侵袭能力,Western blot法检测EMT相关指标E-cadherin和N-cadherin以及其上游信号分子Snail、p-AKT的变化。结果四株卵巢癌细胞中,SKOV3的Cathepsin L表达水平最高(以此为参照),而ES-2、OV1以及OV2细胞的表达水平分别为0.72±0.04、0.34±0.03和0.55±0.05。Cathepsin L-sh RNA转染SKOV3细胞后,SKOV3/sh RNA中的Cathepsin L的表达水平较空白组和对照组显著下降;划痕12 h和24 h后,SKOV3/sh RNA组的细胞迁移能力明显受到抑制;SKOV3、SKOV3/Con和SKOV3/sh RNA组的穿膜细胞数分别为(93.67±8.62)、(90.33±12.22)、(35.67±4.73),与对照组相比,SKOV3/sh RNA组细胞侵袭能力受到显著抑制(P<0.01);Cathepsin L干扰组细胞的E-cadherin表达增加,N-cadherin的表达降低;此外,Cathepsin L干扰组细胞的Snail、p-AKT表达较对照组显著下降。结论 Cathepsin L可以促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭;其机制可能与调节EMT的上游信号分子Snail、p-AKT有关。提示Cathepsin L在卵巢癌的发生发展中起重要作用。

溶酶体组织蛋白酶参与宰后牛肉AIF介导细胞凋亡研究

为研究牛肉宰后成熟过程中凋亡诱导因子(AIF)介导细胞凋亡及溶酶体组织蛋白酶参与AIF活化机制,选取6头西门塔尔杂交牛进行屠宰,取其背最长肌于4℃条件下成熟,在不同成熟时间点(0、6、12、24、72、120、168 h)进行活性氧(ROS)相对含量、溶酶体膜稳定性、组织蛋白酶活性、线粒体膜通透性、AIF表达及细胞核形态的测定。结果表明,宰后成熟过程中,牛肉ROS相对含量呈先降低后升高的趋势(P<0.05);溶酶体膜稳定性逐渐降低(P<0.05);组织蛋白酶B、D和L的活性逐渐升高(P<0.05);线粒体膜通透性增大(P<0.05);AIF在线粒体中的表达量于宰后12 h显著升高,在之后的成熟时间降低(P<0.05),AIF在细胞核中的表达呈上升的趋势(P<0.05),与线粒体中的下降趋势相一致;细胞核体积逐渐增大、部分核溶解,并伴随细胞间隙变大的现象。表明牛肉在宰后成熟过程中生成ROS,ROS的累积导致溶酶体膜稳定性失衡,使组织蛋白酶被释放,作用于线粒体,之后线粒体膜通透性发生变化,释放AIF,活化的AIF进入细胞核内诱导凋亡发生。

褐藻多糖硫酸酯通过溶酶体组织蛋白酶D调节过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡

目的:研究褐藻多糖硫酸酯(fucoidan)对过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(pheochromocytomacells,PC12)凋亡的影响,探讨fucoidan对阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的作用机制。方法:50μg.L-1神经生长因子(nerve growth factor,NGF)诱导分化PC12细胞(differentiated PC12,dPC12)7 d,0.5 mmol.L-1H2O2刺激30 min造成dPC12细胞凋亡。磺酰罗丹明B(sulforhodamine B sodium salt,SRB)法检测不同质量浓度fucoidan(0.1,1,10,50,100 mg.L-1)对细胞存活的影响,筛选适宜药物浓度;荧光底物法检测凋亡细胞内caspase-3的活性及细胞浆中溶酶体组织蛋白酶D的活性;酶-底物法检测不同质量浓度fucoidan(0.01,0.1,1,10,100 mg.L-1)对人肝脏溶酶体组织蛋白酶D活性的影响。结果:fucoidan能够拮抗H2O2所致细胞损伤,以10 mg.L-1作用最为明显;并能降低异常升高的凋亡执行酶caspase-3的活性。fucoidan对H2O2损伤后dPC12细胞胞浆内和人肝脏提取的溶酶体组织蛋白酶D活性均具有抑制作用。结论:fucoidan可以抑制H2O2诱导的dPC12细胞凋亡,其作用机制可能与抑制溶酶体组织蛋白酶D的活性有关。

褐藻多糖硫酸酯对组织蛋白酶B活性影响的实验研究

目的研究褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)对氧化应激损伤及溶酶体组织蛋白酶B活性的影响,探讨Fucoidan用于中枢神经系统疾病的作用机制。方法 50μg.L-1神经生长因子(nerve growth factor,NGF)分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞(differentiated PC12,dPC12)7 d,0.5 mmol/L H2O2刺激30 min,给予10 mg.L-1Fucoidan干预。酶标仪检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及活性氧(reactive oxygen species,ROS)活性;荧光底物法检测细胞质中溶酶体组织蛋白酶B的活性;酶-底物法检测不同浓度Fucoidan(0.1、1、10、50、100 mg.L-1)对人肝脏溶酶体组织蛋白酶B活性的影响。结果氧化损伤后细胞中ROS显著升高达正常水平的185.2%,伴有SOD下降,溶酶体组织蛋白酶B活性上升至正常水平的236.7%;Fucoidan对SOD活性没有明显影响,能降低ROS水平,且对细胞质内和人肝脏溶酶体组织蛋白酶B的活性均具有抑制作用。结论 Fucoidan降低活性氧含量抗氧化损伤的作用可能与其抑制溶酶体组织蛋白酶B的活性有关。

内源性蛋白酶在宰后猪肉成熟过程中的作用

本文分别阐述了两类内源性蛋白酶,即钙蛋白酶和溶酶体组织蛋白酶的结构、性质、影响酶活性的因素及其在猪肉成熟过程中的作用,认为在猪肉宰后成熟过程中,钙蛋白酶发挥的作用更显著。

猪CTSD全长cDNA的克隆和表达分析

以人CTSD mRNA全长序列为基序,在db EST库中搜索同源性大于80%、重叠大于40个碱基的猪EST下载经Seqman软件装配后,利用RT-PCR扩增到猪CTSD基因部分cDNA序列,进一步通过RACE技术获得cDNA全长（GenBank登录号为DQ018727）,猪CTSD基因cDNA全长2032 bp包括93 bp 5′UTR区、706 bp 3′UTR区和1 233bp ORF,编码410个氨基酸残基。其编码区与人、鼠、牛、羊CTSD编码区同源性分别为87.9%、78.2%、86.6%和85.0%,其氨基酸序列与人、鼠、牛、羊氨基酸序列同源性分别为86.6%、80.1%、86.0%和84.7%。疏水性分析和信号肽预测发现猪CTSD氨基酸序列存在至少7个疏水性区域,信号肽位点为第1-20个氨基酸残基。在NCBI进行Blast P搜索结果显示猪CTSD氨基酸结构中含有Asn（Asparagine,天门冬酰胺）结构域,与天冬氨酸蛋白酶3D结构同源性高达99.7%,具有真核生物天冬氨酸蛋白酶的典型结构。以猪多组织RNA池为模板,以1026 bp部分cDNA序列作为杂交探针进行Northern杂交,得到一条2000 bp左右特异条带,从而验证了RACE产物为全长cDNA并揭示该基因只有一个转录本。为了研究猪CTSD基因在体内不同组织内表达的特点,采用半定量RT-PCR对CTSD基因在猪10个组织中的表达进行研究,结果表明在10个组织中均有表达,且表达量与-βactin内参接近。

水产品腐败机理及控制方法研究进展

酶类的水解作用是水产品贮藏过程中腐败变质的主要因素。本文综述了水产品在低温贮藏中的腐败机理及控制方法,分别对前后两个阶段占主导作用的因素内源酶和胞外酶进行了分析,讨论了控制冰点与气调包装结合法、腌制与低温贮藏法、冰温干燥法等延长水产品贮藏期的方法,并对提高水产品品质的方法做出了展望,以期为提高水产品营养价值、延长贮藏期提供指导。

CTSB超表达促进体外培养的猪前体脂肪细胞分化

为研究溶酶体组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)对脂肪细胞分化的影响,本实验构建了Ctsb重组腺病毒超表达载体,包装并侵染体外培养的猪前体脂肪细胞,采用油红O染色,油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化的情况,并通过real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA水平的变化.结果显示,重组腺病毒Ctsb载体构建成功,转染猪前体脂肪细胞后,使Ctsb的mRNA和蛋白质表达量分别提高了约16倍和12倍.CTSB超表达能促进脂肪细胞的分化和脂质积累,成脂关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)、脂肪酸结合蛋白2(adipocyte protein 2,aP2)的表达量均有显著升高.研究表明,提高Ctsb的表达能促进猪前体脂肪细胞分化,揭示了Ctsb在猪前体脂肪细胞分化过程中可能发挥关键作用.研究结果为进一步研究其作用机制奠定了基础.

TRIB3通过抑制CTSZ介导的BCR-ABL降解促进急性淋巴细胞白血病疾病进程

费城染色体Ph阳性急性B淋巴细胞白血病(Ph+B-ALL)是最常见的与染色体异常相关的急性淋巴细胞白血病,该疾病常发于儿童和青壮年,其治疗预后效果较差。研究表明,假性激酶TRIB3(tribbles homologue 3)在肿瘤细胞中高表达,高表达TRIB3能够促进多种肿瘤的发生发展,但是TRIB3在Ph+ALL疾病中的作用及分子机制并不清楚。本研究发现TRIB3在Ph+ALL患者样本中表达上调,高表达TRIB3与断裂点簇基区-Abelson酪氨酸激酶(BCR-ABL)蛋白水平呈现正相关。实验结果进一步表明,敲除TRIB3能够降低BCR-ABL的表达并抑制Ph+ALL的疾病进程。机制研究表明,TRIB3通过与溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶Z(CTSZ)相互作用,进而抑制CTSZ介导的BCR-ABL降解,维持Ph+ALL细胞的增殖和抵抗凋亡能力。综上,本研究表明抑制TRIB3的表达来调控BCR-ABL蛋白水平可能作为Ph+ALL潜在的治疗策略。本实验所有动物实验均通过中国医学科学院药物研究所伦理审查委员会审查。白血病患者血液样本实验通过中国医学科学院伦理委员会批准(伦理号:KT2019055-EC-1)。