褐藻多糖硫酸酯通过溶酶体组织蛋白酶D调节过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡

目的:研究褐藻多糖硫酸酯(fucoidan)对过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(pheochromocytomacells,PC12)凋亡的影响,探讨fucoidan对阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的作用机制。方法:50μg.L-1神经生长因子(nerve growth factor,NGF)诱导分化PC12细胞(differentiated PC12,dPC12)7 d,0.5 mmol.L-1H2O2刺激30 min造成dPC12细胞凋亡。磺酰罗丹明B(sulforhodamine B sodium salt,SRB)法检测不同质量浓度fucoidan(0.1,1,10,50,100 mg.L-1)对细胞存活的影响,筛选适宜药物浓度;荧光底物法检测凋亡细胞内caspase-3的活性及细胞浆中溶酶体组织蛋白酶D的活性;酶-底物法检测不同质量浓度fucoidan(0.01,0.1,1,10,100 mg.L-1)对人肝脏溶酶体组织蛋白酶D活性的影响。结果:fucoidan能够拮抗H2O2所致细胞损伤,以10 mg.L-1作用最为明显;并能降低异常升高的凋亡执行酶caspase-3的活性。fucoidan对H2O2损伤后dPC12细胞胞浆内和人肝脏提取的溶酶体组织蛋白酶D活性均具有抑制作用。结论:fucoidan可以抑制H2O2诱导的dPC12细胞凋亡,其作用机制可能与抑制溶酶体组织蛋白酶D的活性有关。

猪CTSD全长cDNA的克隆和表达分析

以人CTSD mRNA全长序列为基序,在db EST库中搜索同源性大于80%、重叠大于40个碱基的猪EST下载经Seqman软件装配后,利用RT-PCR扩增到猪CTSD基因部分cDNA序列,进一步通过RACE技术获得cDNA全长（GenBank登录号为DQ018727）,猪CTSD基因cDNA全长2032 bp包括93 bp 5′UTR区、706 bp 3′UTR区和1 233bp ORF,编码410个氨基酸残基。其编码区与人、鼠、牛、羊CTSD编码区同源性分别为87.9%、78.2%、86.6%和85.0%,其氨基酸序列与人、鼠、牛、羊氨基酸序列同源性分别为86.6%、80.1%、86.0%和84.7%。疏水性分析和信号肽预测发现猪CTSD氨基酸序列存在至少7个疏水性区域,信号肽位点为第1-20个氨基酸残基。在NCBI进行Blast P搜索结果显示猪CTSD氨基酸结构中含有Asn（Asparagine,天门冬酰胺）结构域,与天冬氨酸蛋白酶3D结构同源性高达99.7%,具有真核生物天冬氨酸蛋白酶的典型结构。以猪多组织RNA池为模板,以1026 bp部分cDNA序列作为杂交探针进行Northern杂交,得到一条2000 bp左右特异条带,从而验证了RACE产物为全长cDNA并揭示该基因只有一个转录本。为了研究猪CTSD基因在体内不同组织内表达的特点,采用半定量RT-PCR对CTSD基因在猪10个组织中的表达进行研究,结果表明在10个组织中均有表达,且表达量与-βactin内参接近。