溶酶体的细胞死亡通路

在溶酶体膜通透化(LMP)之后的细胞急性死亡中,或者在溶酶体催化水解酶释放到细胞外间隙之后的组织浸润过程中,溶酶体水解酶参与溶酶体与自噬小体触合后的自噬物质的消化降解过程。经典的凋亡刺激、细胞内第二信使如自由基、鞘氨醇以及嗜溶酶体毒素等都能诱导LMP,继而LMP又导致线粒体外膜通透化(MOMP)和半胱天冬酶的激活。MOMP和半胱天冬酶激活是细胞凋亡的标志。癌细胞溶酶体不同于正常细胞,参与组织浸润和肿瘤生长的溶酶体酶高表达,热休克蛋白过表达能局部阻止LMP。部分细胞质和细胞器的自噬隔离,参与了细胞对营养缺乏和亚细胞死亡损伤的适应,因此在某种情况下自噬可防止细胞死亡;但凋亡被抑制时,高度自噬又是细胞死亡的效应因子。

检测前列腺癌细胞PC3溶酶体膜通透化模型的构建

目的利用串联红绿荧光蛋白报告基因的溶酶体膜蛋白来检测前列腺癌细胞溶酶体的变化，构建靶向溶酶体膜通透化（LMP）的筛选模型，为后续靶向溶酶体膜通透化的药物筛选奠定基础。方法（1）设计构建串联红绿荧光报告基因标记溶酶体膜蛋白（Lamp2c）的真核表达载体pLamp2C．红色荧光蛋白（mRFP）-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）；（2）荧光显微镜观察pLamp2C—mRFP-EGFP质粒转染人PC3细胞表达情况；（3）用LysoTrackerBlue浓度为55nmol／L的培养基孵育转染后的PC3细胞，共聚焦显微镜下观察pLamp2C-mRFP—EGFP与溶酶体共定位；（4）用40Ixmol／L鞘氨醇的培养基处理转染pLamp2C—mRFP—EGFP的PC3细胞，共聚焦显微镜观察加入鞘氨醇前后红绿荧光的变化。利用ImageJ软件定量分析共定位和红绿荧光变化。结果（1）pLamp2C—mRFP-EGFP真核表达载体构建成功；（2）pLamp2C．mRFP—EGFP瞬时转染至PC3细胞，EGFP及mRFP均正常表达；（3）pLamp2C．mRFP．EGFP与溶酶体共定位结果：Pearson’s相关系数为0．8362±0．0518；（4）经鞘氨醇处理前后，PC3细胞绿色荧光强度为0．1190±0．0223比0．06394-0．0156，明显减弱，差异有统计学意义（t=14．66，P〈0．05），红色荧光强度为0．1049±0．0101比0．1038±0．0109，差异无统计学意义（t=1．136，P〉0．05）。结论成功转染pLamp2C—mRFP—EGFP至PC3细胞溶酶体，鞘氨醇处理后绿色荧光明显减弱，红色荧光无明显变化，指示PC3细胞溶酶体膜通透化。

溶酶体膜通透化在铀诱导肾近端小管上皮细胞死亡中的作用及机制

目的探究铀(Uranium,U)暴露诱导人肾近端小管上皮HK-2细胞溶酶体膜通透化(LMP)致细胞死亡的作用及机制。方法以100、300、600μmol/L铀染毒HK-2细胞24 h,分别采用DCFH-DA荧光探针法和MitoSOX荧光探针法检测不同浓度铀染毒的HK-2细胞内氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和线粒体超氧化物的生成。将HK-2细胞分为:空白对照组、单纯N-乙酰半胱氨酸(NAC)或CA-074 Me组、单纯铀染毒组和铀联合NAC或CA-074 Me组,采用双色免疫荧光法检测HK-2细胞内半乳凝素-1(Galectin-1)与溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)共定位情况以检测溶酶体膜通透化(lysosomal membrane permeability,LMP)程度,或检测Cathepsin B与LAMP-1非共定位情况以反映溶酶体内Cathepsin B的释放情况,钙黄绿素(Calcein-AM)-碘化丙啶(PI)双染色法检测HK-2细胞死亡情况,单色免疫荧光法检测HK-2细胞内Cleaved-caspase-3表达以检测细胞凋亡情况。结果100、300、600μmol/L铀染毒HK-2细胞24 h诱导细胞内ROS或线粒体超氧化物生成与0μmol/L铀对照组比较明显增加,分别为1.1~2.5倍或4.0~28倍(t_(ROS)=17.98、11.84、11.75,P<0.05;t线粒体超氧化物=6.14、16.02、13.06,P<0.05),且随铀浓度增加而显著增加(t_(ROS)=10.10、10.37、5.59,P<0.05;t线粒体超氧化物=21.50、15.16、5.93,P<0.05)。与空白对照组相比,600μmol/L铀染毒24 h使HK-2细胞中Galectin-1和LAMP-1共定位率及Cathepsin B和LAMP-1非共定位率显著增加,分别为5.4~6.7倍或1.5~2.1倍(t_(Galectin-1)=15.85、12.70,P<0.05;t_(Cathepsin) B=5.95、6.69,P<0.05),而给予NAC处理则能抑制其增加(t_(Galectin-1)=4.74,P<0.05;t_(Cathepsin) B=4.51,P<0.05);而且,600μmol/L铀染毒24 h使HK-2细胞死亡率及Cleaved-caspase-3表达水平较空白对照组显著增加,分别为28~47倍或2.4~6.0倍(tPI=30.40、10.34,P<0.05;t_(Cleaved-caspase-3)=18.49、9.52,P<0.05),而给予CA-074 Me处理则能显著降低铀暴露HK-2细胞的死亡率及Cleaved-caspase-3表达水平(tPI=6.76,P<0.05;t_(Cleaved-caspase-3)=13.47,P<0.05)。结论铀暴露诱导HK-2细胞内ROS爆发导致LMP,致使溶酶体内Cathepsin B泄露至胞质中进而触发溶酶体依赖性细胞死亡和线粒体途径的细胞凋亡。

σ-2受体激动剂抑制肿瘤细胞增殖分子机制的研究进展

σ-2受体作为一种膜受体,广泛分布于细胞及各细胞器膜表面,其在肿瘤生物学中的研究价值正得到进一步证实。其在处于高增殖期肿瘤细胞表达量是正常组织细胞的10倍,因此其特异性受体激动剂在肿瘤中更容易通过凋亡或非凋亡手段诱导细胞死亡。σ-2受体激动剂可以激活半胱天冬酶3(caspase-3)依赖的线粒体凋亡通路,但抑制caspase-3并不能完全逆转激动剂诱导的细胞死亡。其影响肿瘤细胞内质网钙离子释放,激活PKC通路,同时诱导细胞产生过多活性氧自由基(ROS),从而改变溶酶体膜通透性,诱导溶酶体内各种组织蛋白酶泄露和改变溶酶体内部酸性环境,导致保护性自噬泡的形成,而过量的自噬最终导致细胞程序性细胞死亡。不同受体激动剂影响不同细胞周期蛋白的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,并把肿瘤阻滞在不同的细胞周期。本文主要对σ-2受体激动剂诱导肿瘤细胞程序性细胞死亡机制进行了综述,加深其在肿瘤中作用的认识。