滇龙胆草中香叶醇10-羟化酶基因的克隆、蛋白结构及表达分析

本研究基于滇龙胆草转录组数据分析,使用RT-PCR技术克隆获得两条香叶醇10-羟化酶基因,命名为GrG10H1和GrG10H2。使用在线软件对其进行了生物信息学分析,两条基因全长分别为1548 bp、1482 bp。系统进化分析显示该基因与细胞色素P450家族中CYP76B亚家族亲缘关系最近。通过对该蛋白进行三维结构预测、同源模建和分子对接,分析了GrG10H蛋白活性口袋中可能参与催化功能发挥的关键氨基酸残基。荧光定量PCR表明GrG10H1基因在叶中表达水平最高,茎次之,根最低。而GrG10H2基因在根和叶中表达水平较高,在茎中几乎不表达。本研究还建立了能够生产龙胆苦苷的愈伤组织细胞培养体系,为进一步解析龙胆苦苷生物合成机制奠定了基础。

云县滇龙胆草产业发展存在的问题及对策

云县高寒冷凉山区脱贫致富、乡村振兴的支柱产业是以滇龙胆草为主的中药材产业,近年来以滇龙胆草为主的中药材产业发展趋势放缓,中药材产业可持续发展乏力。为了持续巩固云县国家区域性中药材良种繁育基地、“云药之乡”品牌创建成果,通过以云县滇龙胆草产业发展为例,从滇龙胆草产业发展现状、优势和瓶颈方面进行了调查研究,结果表明,没有完善的产业发展科技服务体系、没有形成完整的产业链制约了云县滇龙胆草产业的健康可持续发展。建议云县进一步建立健全产业发展科技服务体系,强化人才队伍建设增强科技服务产业能力,培育产业龙头增强内生动力,发挥合作社作用助力产业振兴。

不同种植模式对滇龙胆草总裂环烯醚萜苷含量的影响

滇龙胆草（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.）为龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana Linn.）多年生草本植物，主要分布于云南、四川、贵州、湖南和广西等地，生长于山坡、草地、灌丛、林下及山谷中。该种为传统中药龙胆的基源植物，其干燥根及根茎均可入药，具有清热燥湿和泻肝胆火的功效。因其资源需求量逐年增加，滇龙胆草的人工种植越来越普遍，并出现了多种种植模式。目前滇龙胆草主要种植模式有单一种植和林药复合种植，常见的有滇龙胆草与茶树也Camellia sinensis （Linn.） Kuntze页、桉树（Eucalyptus robusta Smith）、木瓜也Chaenomeles sinensis （ Thouin ） Koehne 页和旱冬瓜（ Alnus nepalensis D. Don）的复合种植模式。与传统林业系统相比，林药复合系统具有良好的生态效益、社会效益和经济效益。周幸的研究结果表明：在太行山山地林药复合种植模式中，分布于土壤表层的药用植物浅根系对表层土有加筋固着作用，可减少水土流失。 Sujatha 等认为：在槟榔（Areca catechu Linn.）园间作芳香药用植物有助于提高其产量并增加单位面积收入。目前有关林药复合种植的研究主要集中于其生态效益和经济效益，对复合种植模式下药用植物有效成分变化的研究尚不多见。

滇龙胆草种子萌发及育苗研究

在野生状态下滇龙胆草种子萌发和幼苗生长较为缓慢,为了探索加快种子萌发和幼苗生长的方法,对滇龙胆草种子采取了不同播种基质、不同播种深度、不同播种基质含水量及不同育苗方式播种育苗。结果表明:滇龙胆草种子萌发及幼苗生长适宜的播种基质应有较好的透气、透水性,适宜的播种深度不超过1.5 cm,播种适宜的土壤含水量为40%～50%;为提高种子出苗率且缩短出苗时间,生产上可考虑使用漂塑料薄膜覆盖育苗及播种前对种子进行催芽处理。

滇龙胆草资源调查及繁殖特性研究

对滇西南地区滇龙胆草在自然状态下的生长环境、生长特性、繁殖特性、开花物候以及资源状况等进行了考查。结果表明:滇龙胆草的野生种群在自然状态下仅为间断分布且种群内的植株数量较少,自种子萌发至植株开花结实需3年以上;开花后及时授粉,传粉方式以自花传粉为主,授粉后5～8 d子房开始膨大,果实成熟期为60d左右,自然状态下结实率(88%)较高但种子萌发率(0.3%)较低;分蘖繁殖能力较低,每丛1年仅萌生1～2条茎;野生生境下滇龙胆草群体的更新主要是通过有性繁殖实现的。

滇龙胆草种子休眠机制与萌发特性初步研究

为探索滇龙胆草种子的休眠机制及解除种子休眠的措施,对滇龙胆草种子采取了休眠程度测定、种子萌发时吸水规律测定、种子休眠机制的生物学鉴定、室温贮藏下种子生活力变化测定及低温层积处理效果。结果表明:新采集的滇龙胆草种子较经低温(4℃)贮藏了1年的种子萌发时间长;由于种皮相对透水、透气差,在室温下种子需经39 h才能充分吸水膨胀;新采集的滇龙胆草种子中有可溶于水的萌发抑制物,其水浸提液对白菜籽萌发及胚根生长均有抑制作用;滇龙胆草种子在室温下贮藏时,随着贮藏时间的延长,其活力逐渐下降,在生产实践中,种子在室温下的贮藏时间不宜超过6个月;一定时间的低温层积处理有利于种子萌发,为缩短刚采收种子的萌发时间,50～80 d的低温层积处理效果相对较好。

濒危植物滇龙胆草的生态学、生物学特性研究

在滇西南地区对滇龙胆草(Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.)在自然状态下的生长环境、生长特性、繁殖特性、开花物候期以及资源状况等进行了考察。结果表明,滇龙胆草的野生种群在自然状态下仅为间断分布且种群内的植株数量较少,自种子萌发至植株开花结实需3年以上时间;开花后授粉方式以自花授粉为主,授粉后5～8 d子房开始膨大,果实成熟期为60 d左右,自然状态下结实率较高(82.4%),但种子萌发率(0.3%)较低;分蘖繁殖能力较低,每丛植株当年仅萌生1～2支茎。野生生境下滇龙胆草群体的更新主要是通过有性繁殖实现,自身繁殖缺陷及人为掠夺性采集是滇龙胆草野生资源濒危的主要原因。

滇西南药用植物滇龙胆草的致危因素和保护策略探讨

滇龙胆草过去在云南西南部野外分布范围较广,每年的采挖量也较多,但现在其分布范围正日趋缩减,自然状态下的种群已不多见,且种群内植株数量较少,已陷入濒危境地。滇龙胆草的濒危原因既有其自身的生理因素,也有人为和气候方面的因素。要使滇龙胆草资源能持续利用,除保护生态环境,实施就地保护外,积极开展人工栽培和实施易地保护措施等也是对其保护的有效策略。

滇龙胆草抑制MAPK信号通路对小鼠肺纤维化的影响

目的研究滇龙胆草对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的保护作用及对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响。方法小鼠分为6组,正常对照组,模型对照组,吡非尼酮组,滇龙胆草小、中、大剂量组,每组10只。除正常对照组外,其他组气管滴注博莱霉素(5 mg·kg^(-1))制备小鼠肺纤维化模型,滇龙胆草小、中、大剂量组,造模后灌胃给予小、中、大剂量(50,100,200 mg·kg^(-1))滇龙胆草,吡非尼酮组灌胃给予吡非尼酮50 mg·kg^(-1),正常对照组和模型对照组给予等量0.5%羧甲基纤维素钠溶液,每日给药1次。在建模后第28天,取肺组织进行检测,苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠肺组织炎症程度;Masson染色观察肺组织纤维化程度;采用Western blotting检测肺组织中p38、JNK、Erk1/2、IL-13、CollagenⅠ蛋白的表达。结果与正常对照组比较,模型对照组小鼠肺组织结构破坏,肺泡壁增厚,肺间质可见大量纤维组织增生、胶原沉积,肺组织中CollagenⅠ,IL-13,JNK,p38,Erk1/2蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,滇龙胆草各剂量组及吡非尼酮组胶原沉积均减少,肺组织病变改善,肺组织中CollagenⅠ、IL-13、JNK、p38、Erk1/2蛋白表达水平均显著下调(P<0.05)。结论滇龙胆草能减轻博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化,其机制与抑制MAPK信号通路和下调IL-13表达有关。

滇龙胆草对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的干预作用

目的研究滇龙胆草对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的干预作用。方法气管滴注博莱霉素(5 mg/kg)制备昆明小鼠肺纤维化模型,造模后灌胃给予低、中、高剂量(50、100、200 mg/kg)的滇龙胆草,给药1次/d。分别在建模后第14、28天处死小鼠,取肺组织进行检测。称肺重量,检测肺系数,HE染色观察小鼠肺组织炎症程度;Masson染色观察肺组织纤维化程度;羟脯氨酸试剂盒测定小鼠肺组织中羟脯氨酸含量;采用Western blot检测肺组织中α平滑肌肌动蛋白α-SMA的表达情况。结果滇龙胆草能够明显减轻肺纤维化小鼠肺组织炎症和胶原沉积,降低肺泡炎和纤维化评分,降低肺纤维化小鼠肺系数和羟脯氨酸含量,下调肺组织α-SMA蛋白表达。结论滇龙胆草通过早期肺部炎症和后期胶原沉积抑制肺纤维化形成,其抗肺纤维化机制与下调α-SMA表达、抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化有关。

滇龙胆草对肺纤维化小鼠肺组织NF-κB和CTGF表达的影响

目的研究滇龙胆草对肺纤维化小鼠肺组织NF-κB和CTGF表达的影响。方法气管滴注博莱霉素(5 mg/kg)制备昆明小鼠肺纤维化模型,造模后灌胃给予低、中、高剂量(50、100、200 mg/kg)的滇龙胆草,每日给药1次,设比非尼酮为阳性对照。在建模后第28天,取肺组织进行检测,肉眼观察肺组织大体病理改变,Masson染色观察肺组织纤维化程度;采用Western blot检测肺组织中NF-κB和CTGF蛋白的表达。结果与模型组比较,不同剂量的滇龙胆草组和阳性药物比非尼酮组小鼠肺组织胶原沉积明显减少。与模型组比较,不同剂量的滇龙胆草组和阳性药物比非尼酮组小鼠肺组织NF-κB和CTGF蛋白表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论滇龙胆草具有抗肺纤维化作用,其机制与下调NF-κB和CTGF蛋白表达,减轻肺组织炎症和胶原沉积有关。

海拔对苍山地区野生滇龙胆品质的影响

目的:本论文旨在研究海拔对苍山地区野生滇龙胆(Gentiana rigescens Franch.)品质的影响。方法:采用高效液相色谱(HPLC)法对滇龙胆根茎叶中龙胆苦苷的含量进行测定,并将各部分龙胆苦苷含量与海拔高度进行相关性分析。结果:苍山地区滇龙胆品质优良,根茎叶三部分龙胆苦苷含量均超过《中国药典》规定,根部龙胆苦苷含量在3.9%~8.2%之间。此外,根部龙胆苦苷含量与海拔高度有显著线性相关性,其线性拟合方程为y = −0.2752 + x * 1.35048E−4。结论:苍山地区野生滇龙胆品质优良;在海拔2325.3~2599.7 m区间内,滇龙胆品质随海拔上升而升高;苍山地区海拔2400~2700 m范围内,是潜在的优良人工滇龙胆种植区。

滇龙胆草的价值与人工栽培技术

云南省云县地处滇西南部,土壤条件优越,物种丰富,是云南省生物多样性最富集的县份之一。2000年云县开始移植野生滇龙胆草进行人工驯化栽培成功以来,种植面积逐年增加,2009年云县正式被认定为以滇龙胆草为主要品种的“云药之乡”。2008年以来,全县12个乡镇山区半山区均有人工驯化栽培滇龙胆草的种植,发展滇龙胆草种植已成为山区、半山区农民增收致富新的经济增长点。目前,云县已成为云南省滇龙胆草主产区,年产量占全省产量80%以上。截至2021年底,全县滇龙胆草种植面积约为15万亩,总产值突破2亿元。掌握滇龙胆草的人工栽培技术是发展滇龙胆草产业的关键。

不同树龄茶树套种滇龙胆对药材矿质元素含量的影响

采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）与不同树龄（3年、4年、5年、9年、12年和15年）茶树（Camellia sinensis）套种后其根、茎、叶3个部位及生长土壤中7种矿质元素（B、Ca、Cu、Fe、Mn、Ni和Zn）的含量。结果显示,滇龙胆中矿质元素平均含量高低顺序为Ca（5 238±2 111）μg/g、Fe（622±238）μg/g、Mn（379±301）μg/g、Cu（75±9.1）μg/g、Zn（46±13）μg/g、B（17±4.9）μg/g、Ni（5.6±3.1）μg/g,与土壤矿质元素含量变化趋势基本一致。根部的B、Ca、Fe、Mn、Ni元素在树龄15年茶树-滇龙胆套种后含量最高,分别为18、3 797、1 050、254、11μg/g,Cu、Zn元素在树龄12年的茶树-滇龙胆套种中含量最高,分别为244、38μg/g。相同营养器官不同树龄的茶树-滇龙胆套种后矿质元素含量具有差异,以根部的Cu、Mn元素含量差异显著,变化范围分别为19~244μg/g和79~254μg/g,分别相差12.8倍和3.2倍;树龄15年、9年的茶树-滇龙胆套种后茎部的Cu含量分别为177、11μg/g,相差16.1倍;树龄3年、5年的茶树-滇龙胆套种后叶部的Cu含量分别为325、11μg/g,相差29.5倍。不同树龄的茶树-滇龙胆套种后根部与土壤矿质元素的相关性以及生物富集系数不同,树龄15年的茶树-滇龙胆套种后根部对Ca、Cu、Mn、Ni、Zn元素的富集能力较强,生物富集系数分别达21.0、3.3、2.2、1.8和4.7。说明茶树复合种植可改变土壤矿质元素的分布,自身生物学特性与复合种植的生态环境共同影响了滇龙胆对矿质元素吸收与运输的能力。

滇龙胆漂浮育苗基质的优选

以滇龙胆(Gentiana rigescens Franch)成熟种子为试材,采用正交试验设计分析育苗基质珍珠岩、蛭石、草炭、腐殖土4个因素对滇龙胆漂浮育苗种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明,滇龙胆漂浮育苗种子萌发的最佳基质配比是珍珠岩∶蛭石∶草炭∶腐殖土=3∶1∶3∶4,种子萌发率达93.4%,珍珠岩和腐殖土对种子萌发率有显著影响,蛭石和草炭对种子萌发作用不显著;滇龙胆漂浮育苗幼苗生长的最佳基质配比是珍珠岩∶蛭石∶草炭∶腐殖土=2∶1∶3∶4,幼苗高、根长及茎叶干重均显著高于其他基质配比,幼苗根干重极显著高于其他基质配比,为(0.281 9±0.001 4)g。

林药复合种植的滇龙胆中元素的化学计量特征研究

药用植物复合种植是对传统中药材种植模式的优化,在一定程度上可缓解中药材与作物争地的矛盾,对中药资源的保护与可持续发展具有重要意义。试验通过采集单一种植模式的滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）样品以及滇龙胆与茶树[Camellia sinensis（L.）O.Ktze]、大叶桉（Eucalyptus robusta Smith）、木瓜[Chaenomeles sinensis（Thouin）Koehne]、旱冬瓜（Alnus nepalensis D.Don）、核桃（Juglans regia L.）、杉木[Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.]、木果石栎[Lithocarpus xylocarpus（Kurz）Markg.]等林药复合种植模式的滇龙胆样品,用微波消解-ICP-AES法测定各滇龙胆样品中的Ca、Mg、Fe、Zn、P、Cu、Mn、Cd、Pb、Ni、Sr、Ti等元素含量,以探明不同种植模式下滇龙胆植株中元素的化学计量特征。结果表明,该方法的加标回收率在95.40%~108.25%,相对标准偏差在0.26%~2.08%。其中滇龙胆根中的元素含量排序为Ca、Fe、Mg、P、Mn、Zn、Ti、Sr、Ni,茎、叶中的为Ca、Mg、P、Fe、Mn、Zn、Sr、Ti、Ni。以滇龙胆-茶树复合种植模式的P元素含量最高,其在根、茎、叶中分别为1 384.73、1 640.12、2 399.04μg/g;滇龙胆-旱冬瓜复合种植模式的Fe和Ti元素含量最高;滇龙胆-大叶桉复合种植模式的Mg元素含量最高,其根、茎、叶中分别为1 486.08、2 770.99、4 673.24μg/g;滇龙胆-核桃复合种植模式的Sr元素含量最高,其根、茎、叶中分别为37.02、52.80、34.63μg/g。重金属元素Cd与Ca、Fe、Ni元素含量之间呈显著或极显著正相关,相关系数分别为0.741、0.929、0.893;Ni与Fe、Ti含量之间呈显著或极显著正相关,与Pb含量之间呈显著负相关;Mg与Cu含量之间呈显著正相关,Mn与Sr含量之间呈极显著正相关。

层积和赤霉素协同作用对滇龙胆种子漂浮育苗的影响

以滇龙胆(Gentiana rigescens Franch)成熟种子为试验材料,采用L9(34)正交设计方法研究层积方式、层积时间、赤霉素稀释液浓度和浸种时间对滇龙胆种子漂浮育苗的萌发及成苗的影响。结果表明,滇龙胆种子漂浮育苗促进萌发的最佳处理组合是湿沙层积方式+层积60 d+赤霉素稀释液浓度200 mg/L+浸种24 h,其中层积时间对滇龙胆种子萌发率有极显著的影响(P<0.01),赤霉素稀释液浓度对滇龙胆种子萌发率有显著的影响(P<0.05),而层积方式和浸种时间对滇龙胆种子的萌发作用不显著;滇龙胆种子漂浮育苗促进成苗的最佳处理组合是一般层积方式+层积30 d+赤霉素稀释液浓度50 mg/L+浸种24 h,其中赤霉素稀释液浓度对滇龙胆种子的成苗率有显著的影响(P<0.05),而层积方式、层积时间和浸种时间对滇龙胆种子的成苗作用不显著。综合考虑各种因素的影响,滇龙胆种子漂浮育苗促进萌发及成苗的最佳处理组合是一般层积方式+层积30 d+赤霉素稀释液浓度50 mg/L+浸种24 h,其种子萌发率为90.23%、成苗率高达97.50%。

滇龙胆优质种质筛选及离体培养条件优选研究

以大理州不同居群滇龙胆(Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.)、同一居群不同植株为试验材料,采用高效液相色谱法(HPLC)对滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷的含量进行测定;再以龙胆苦苷含量≥7.0%的优质种质资源为外植体,采用正交试验设计方法研究培养基、蔗糖浓度、pH及培养温度对滇龙胆离体培养植株再生的影响。结果表明,大理州6个居群滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量较高,不同居群间龙胆苦苷含量具有显著差异(P<0.05),以鹤庆县居群的龙胆苦苷含量最高(80.70 mg/g),含量最低的巍山县居群也超过国家药典规定标准的2倍多;同一居群内不同植株滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量差异较小,只有云龙县居群不同植株间具有显著差异(P<0.05),其他居群不同植株间无显著差异(P>0.05);滇龙胆生长点离体培养及植株再生最适培养基和培养条件是1/2MS+30 g/L蔗糖+pH 5.2+20℃/25℃变温培养,再生植株诱导率最高可达88.9%,试验初步建立了滇龙胆离体培养及植株再生体系。

四种龙胆的显微结构特征比较

为比较红花龙胆(Gentiana rhodantha)与翼萼龙胆(Gentiana pterocalyx)、滇龙胆(Gentiana rigescens)与头花龙胆(Gentiana cephalantha)的显微结构差异,用石蜡组织切片法及徒手切片法对4种龙胆的显微结构进行了研究。结果表明,红花龙胆与翼萼龙胆、滇龙胆与头花龙胆显微结构特征有明显区别。在根横切面方面,红花龙胆皮层厚,导管细胞横切口径小,无明显射线,翼萼龙胆的特征与红花龙胆的相反;滇龙胆与头花龙胆的表皮和皮层早脱,次生韧皮部发达,但滇龙胆韧皮部薄壁组织细胞较大,而头花龙胆较小。在茎横切面方面,红花龙胆中央髓约占切面的1/3,而翼萼龙胆约占切面的1/2;滇龙胆髓仅外部有散落分布的纤维束,头花龙胆髓部均可见纤维束散落分布。在叶横切面方面,红花龙胆中脉维管束较大,而翼萼龙胆较小;滇龙胆中脉维管束小,未见纤维束,头花龙胆中脉维管束大,纤维束成对位于木质部两侧。在叶表皮方面,4种植物表皮细胞径向壁波曲度与气孔指数有一定差异。根据显微结构特征可以将这4种植物区别开来。

滇龙胆草野生资源的地理分布与生物气候特征

利用国家标本资源共享平台提供的物种分布数据,结合野外实地调查和MaxEnt模型对滇龙胆草适宜分布区进行模拟和验证,分析滇龙胆草地理分布与气候因子间的关系.结果表明:模型训练集和验证集曲线下面积(area under curve,AUC)值均>0.90,表明模型预测精度高,预测结果较准确.滇龙胆草分布区地理坐标范围:22.2°-28.75°N,98.48°-110.59°E.适宜的海拔范围为1830^1959 m.适生区总面积约63.92×10^4 km^2;其中,高度适生区4.33×10^4 km^2,中度适生区21.42×10^4 km^2.云南、四川、贵州3省适生区面积合计约59.10×10^4 km^2,占全国适生区面积的92.46%.影响滇龙胆草地理分布的主要气候因子有3、6和8月太阳辐射,温度年较差,最暖季均温,10月和11月平均降水量及最干季降水量.偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)分析表明,分布区以北和以东的太阳辐射(3月、6月和8月)、温度年较差、10-11月平均降水量、最干季降水量是主要的限制因子;分布区以南主要限制因子是6月太阳辐射、最暖季均温、10月和11月平均降水量.限制滇龙胆草向四川盆地、广西盆地分布的主要气候因子是太阳辐射、温度年较差、最暖季均温、年生物温度和年可能蒸散量.综合分析认为,滇龙胆草的适生区主要位于云贵高原,上述地区的亚热带湿润气候最适宜滇龙胆草生长.