滑液囊支原体与鸡传染性支气管炎病毒共感染对SPF鸡的致病性研究

为比较滑液囊支原体(MS)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)共感染对SPF鸡的致病性,本研究将144只28日龄SPF鸡随机均分为阴性对照组、MS感染组、IBV-M41感染组、IBV-M41+MS共感染组、IBV-QX感染组、IBV-QX+MS共感染组共6组,采用50μL/只剂量按相应分组点眼感染MS (106CCU50)、IBV(105EID50),阴性对照组以50μL/只点眼KM2培养基(左眼)和PBS (右眼)。感染后每天观察临床症状,在感染后7 d、14 d、21 d和28 d每组随机剖检6只鸡,观察气囊炎和气囊损伤评分,并采集气管进行病原再分离,其中MS经支原体液体培养基培养后进行PCR鉴定,IBV接种SPF鸡胚后进行RT-PCR鉴定。此外,各组鸡气管均经10%甲醛固定后进行粘膜厚度检测以及病理损伤评分。结果显示:除阴性对照组和MS感染组,其他组鸡在感染后4 d均出现一过性呼吸道症状。剖检结果显示MS感染组鸡在感染后21 d出现气囊炎,28 d仍可见气囊炎;而IBV-M41感染组和IBV-QX感染组鸡在感染后7 d或14 d出现气囊炎,且气囊炎的发生率均未超过50%。感染后14 d IBV-QX+MS共感染组鸡气囊炎发生率达100%(6/6),直至21 d并且大部分鸡气囊炎可持续至感染后28 d (5/6),而IBV-M41+MS共感染组鸡气囊炎仅可持续至感染后21 d,且气囊炎的发生率最高在感染后14 d (5/6)。IBV-QX+MS共感染组鸡平均气囊损伤评分在感染后14 d、21d和28 d均极显著高于单一感染组(P<0.001),而IBV-M41+MS共感染组鸡仅在感染后14 d极显著高于单一感染组(P<0.001)。病原再分离结果显示,各感染组鸡均在气管中再分离到MS(感染后28 d内)或IBV(感染后7 d内)。病理损伤检测结果显示,共感染组鸡较各单一感染组鸡气管粘膜增厚持续时间更长以及病理损伤更为严重。IBV-M41+MS共感染组鸡在感染后14 d平均气管粘膜厚度显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.05),而在感染后21 d极显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.001),其余各组鸡在感染后14 d和21 d均极显著低于IBV-QX+MS共感染组鸡(P<0.001)。IBV M41+MS共感染组鸡最早14 d出现气管病变,而IBV QX+MS共感染组鸡在共感染后7 d就可见气管病理损伤,且共感染组鸡的平均气管损伤评分均极显著高于单一MS或IBV感染组(P<0.01或P<0.001)。上述结果证实MS和IBV共感染较单一感染对28日龄SPF鸡的致病性更强,IBV M41或QX株与MS共感染对SPF鸡的致病性存在差异,本研究为临床IB和MS的防控提供科学参考依据。

安徽部分地区鸡场鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体感染与垂直传播调查

为了解安徽部分地区规模鸡场鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)流行感染情况,试验采集21家鸡场鸡血液样品进行血清学调查,并对3家种鸡场的种鸡群及其后代雏鸡进行MG和MS的病原检测,分析种鸡及其后代雏鸡的感染情况。结果显示,MG和MS的鸡场血清阳性率分别为95.24%和90.48%,鸡群平均血清阳性率分别为75.08%和77.01%;商品蛋鸡和种鸡的MG和MS血清阳性率高于育雏育成鸡;鸡群日龄越大,MG和MS的血清阳性率越高,其中300日龄以上鸡群的血清阳性率均为100%。病原检测发现,种鸡场存在不同程度的MG和MS感染,其中MS感染率高于MG;种鸡感染率与其后代雏鸡的垂直感染存在显著正相关,并且在垂直感染的雏鸡关节组织检测出MS病原。结果表明,MG和MS在安徽鸡场中的感染较为严重,垂直传播是雏鸡早期感染的重要途径,并且MS在雏鸡垂直感染的早期即可侵入关节组织。

鸡滑液囊支原体PCR检测方法的建立

目前鸡滑液囊支原体(MS)在养鸡生产中时有发生,是一种顽固性、条件性疾病。在多种致病因素的作用易发,给养鸡生产造成了经济损失;为了快速诊断MS,特别是致病性鸡滑液囊支原体,本研究针对MS的VlhA基因设计特异性引物,通过优化反应条件,进行灵敏性试验、特异性试验和重复性试验,建立快速高效检测MS的PCR方法。试验结果表明:该检测技术具有较好的灵敏性、特异性强且CV<3%,具有很好的符合性。

鸡滑液囊支原体病及其诊断与防治的研究进展

滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)可引起鸡的急性或慢性呼吸道疾病、传染性滑膜炎、空气传染病和蛋壳顶端异常等疾病,对家禽业造成了巨大的经济损失。文章就鸡滑液囊支原体病的流行病学、致病特点、临床症状、诊断方法和防控措施进行综述,对鸡滑液囊支原体病的诊断技术及疫苗的研发及应用前景进行展望,以期为该病的临床防控提供参考。

鸡滑液囊支原体DnaK基因体外表达、纯化及鉴定研

本试验通过对热休克蛋白(DnaK)的基因片段测序分析后,去除多余启动子、终止密码子等并进行修饰,将目的基因片段DnaK通过体外蛋白表达系统进行蛋白表达,结果得到了目的蛋白,并验证其来自上清液,大小为27.5 kDa,为下一步蛋白疫苗的制备提供理论依据和试验素材。

蛋鸡养殖中滑液囊支原体病的综合防治

蛋鸡滑液囊支原体病是由于鸡只感染了滑液囊支原体而引发的一种慢性传染病。通常患病的蛋鸡因出现腿、趾部位关节滑液囊膜炎或腱鞘炎而导致鸡产生跛行等症状,有的鸡可出现呼吸道症状。育成期蛋鸡发病直接影响鸡体的生长发育,产蛋期蛋鸡发病导致整体产蛋率大幅下降,鸡群产蛋总量明显减少,从而直接影响着蛋鸡养殖户的经济收益。

中药和益生菌组方防治鸡滑液囊炎支原体的应用研究

试验旨在验证中药和益生菌在防治鸡滑液囊炎支原体病方面的作用,以期有效防控鸡滑液囊炎支原体病的流行。试验采用体外筛选出具有抑制鸡滑液囊炎支原体(MS)的中草药(甘草、蒲公英),再辅以桑枝与川芎两味具有活血化瘀功能的中草药,与两株具有显著提高机体免疫力的植物乳杆菌BLCC2-0418、BLCC2-0287形成中药与益生菌组方,并构建MS模型,考察了中药与益生菌组方对MS感染肉鸡的治疗效果。结果显示:中药与益生菌组方能够显著缓解由于攻毒导致的采食量下降引起的体重降低以及足垫厚度和关节直径增高的现象,减轻关节损伤;可提高肉鸡血清免疫球蛋白G(IgG)抗体水平,提高机体免疫力;可降低血清中炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)含量,提高血清中抗炎性因子白细胞介素-10(IL-10)含量,可抑制关节炎症反应,对MS导致的关节病变可起到积极的治疗作用。研究表明,中药与益生菌组方可以降低由于感染MS导致的关节损伤。

纳米氮化硼切削润滑液在切削加工中的应用

总结了近年来改性BN在油基切削液和水基切削液两类切削液的研究现状及发展趋势,并对其应用趋势和技术难点进行了分析与讨论,提高BN在液体润滑剂体系中的分散效果、不断降低润滑液成本以及追求绿色环保制备技术将是今后的主要发展方向。

三种血清学方法和qPCR方法在鸡滑液囊支原体检测中的综合应用研究

为评价不同方法对鸡滑液囊支原体(MS)活疫苗免疫和非免疫状态鸡群的监测效果,研究分别采用HI、SPA与ELISA三种抗体检测方法和qPCR方法同步对某养殖场A、B和C三组鸡群进行MS感染和抗体水平监测,其中A鸡群23日龄免疫MS活疫苗(MS-H株),B、C鸡群不免疫MS疫苗。结果显示:三种血清学检测方法所测MS抗体阳性率趋势基本一致,HI抗体效价变化规律和ELISA抗体效价变化规律相似,但血清学方法相对于qPCR方法具有一定的滞后性,qPCR可以最早发现MS野毒感染,且在使用活疫苗免疫的情况下对疫苗和野毒进行鉴别检测。研究提示:在条件允许的情况下,qPCR可以作为MS首选的监测方法;当检测条件受限时,上述三种血清学方法同样也可以用于评估MS野毒感染状况,但对结果的判断受母源抗体水平、疫苗免疫状况、野毒感染时间等多重因素的影响,在结果判断时应进行综合分析。

鸡滑液囊支原体的分离鉴定及药敏试验

为弄清湖北省某蛋鸡场180日龄鸡群出现呼吸道症状和产蛋率下降的病原,采集病料进行病原的分离鉴定与药敏试验,用形态学观察方法和分子生物学方法对分离株进行了形态学观察和16S rRNA基因鉴定,并用鸡胚感染试验对分离株进行致病性试验。结果显示,病原分离鉴定结果仅滑液囊支原体阳性,镜检观察到典型的“煎蛋样”菌落;16S rRNA序列与已报道的滑液囊支原体的具有高度同源性;鸡胚感染试验显示,分离株导致鸡胚发育迟缓,胚体弱小,从弱小胚体内可再次分离出滑液囊支原体;药敏试验结果显示滑液囊支原体分离株对泰妙菌素、四环素和盐酸克林霉素敏感。结果表明,从产蛋下降的鸡群中成功分离到1株滑液囊支原体,为临床该病的防治提供了科学依据。

滑液囊支原体GA组件蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】体外表达滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的GA组件蛋白(GA module-containing protein),建立一种MS抗体检测方法,用于血清学检测及MS抗体水平监测。【方法】分析、筛选MS的GA组件蛋白长链保守结构域,合成重组质粒pET30a-ΔGA-L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,并优化表达条件;通过SDS-PAGE检测重组蛋白的表达,纯化重组蛋白ΔGA-L并进行Western blotting鉴定;以纯化后的重组蛋白ΔGA-L作为包被抗原,建立MS抗体的间接ELISA检测方法,优化反应条件,确定临界值,对其特异性、敏感性、重复性进行检验,并进行临床样品检测。【结果】重组蛋白ΔGA-L的分子质量大小为45.7 ku,最佳表达条件为25℃、0.2 mmol/L IPTG诱导表达5 h,以包涵体形式表达。Western blotting结果表明,重组蛋白ΔGA-L能与MS抗体发生特异性反应。以ΔGA-L抗原包被浓度为0.5μg/mL,一抗稀释度为1∶400,二抗稀释度为1∶12 000为最佳条件,建立了MS抗体间接ELISA检测方法,其阴阳性临界值为0.283;所建立方法特异性强、灵敏度高,有较高稳定性;与商品化MS抗体检测试剂盒总符合率为96%。【结论】本研究成功表达了MS重组蛋白ΔGA-L,所建立的MS抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为MS抗体检测提供了有效快捷的方法。

6株禽源滑液囊支原体分离株的分子生物学鉴定及MSPB蛋白原核表达

从分子水平对6株禽源滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)分离株进行鉴定,探讨MS宁夏本地株膜蛋白MSPB的生物学功能。通过PCR技术扩增分离株的16S rRNA和MSPB基因序列,并构建分子进化树,对6株MS分离株进行同源性分析;用生物信息学工具对MSPB在蛋白水平进行分析,预测其亚细胞定位,探究MSPB的理化性质。构建pET-30a-MSPB重组表达载体,在大肠埃希氏菌BL 21(DE3)中进行表达,用镍柱亲和层析纯化并用蛋白质免疫印迹验证其反应原性。结果6株MS分离株在16S rRNA基因序列上与MS参考菌株具有同源性;MSPB等电点低,疏水性氨基酸占比较高;成功对MSPB进行表达,大小约为70 ku,纯化所得MSPB蛋白能与MS阳性血清特异结合。结果表明,6株菌株为MS,而MSPB具有反应原性,可以作为候选抗原应用于MS的诊断或防控。

鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备及其免疫保护效果研究

为了研究鸡滑液囊支原体灭活疫苗在不同剂量下的免疫保护效果,该研究以40只20日龄健康海蓝褐雏鸡为研究对象,将鸡滑液囊支原体Q5-2菌株制成的灭活疫苗分3个剂量组对其进行免疫,共免疫3次。利用ELISA检测每组鸡的血清抗体效价,免疫结束后将全部蛋鸡经滴鼻、滴眼途径进行攻毒,检验疫苗的保护效力。结果表明:(1)与对照组相比,3个剂量组2次加强免疫后抗体效价迅速升高,其中低剂量组抗体效价持续上升,达到峰值时的抗体效价也最高为1∶158000,3个剂量组之间差异显著(P<0.05);(2)疫苗接种后对强毒攻击的保护率,低剂量组为100%,中、高剂量组为80%,随着攻毒后时间的延长疫苗接种组从咽拭子中分离出支原体的概率明显低于对照组。表明制备的鸡滑液囊支原体灭活疫苗能刺激机体产生良好的免疫应答,对于强毒攻击具有较好的抵抗作用,并对强毒感染后动物的排毒起到一定抑制作用,从而为该病疫苗的开发及防控方面的研究提供参考依据。

滑液囊支原体感染与“球痢灵”中毒鉴别诊断

肉鸡感染鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)和临床上不规范使用“球痢灵”均容易导致肉鸡中毒出现“肿脚”现象,两种病在临床症状和剖检病变上有许多相似之处,现从发病原因、临床症状和剖检病变等方面探讨鉴别诊断的方法。

2019-2022年我国部分地区鸡滑液囊支原体分离株基因分型及vlhA基因进化分析

为了解我国鸡滑液囊支原体(MS)的最新感染情况,试验对2019-2022年在我国河南、河北、山东、安徽、江苏5个省份收集的152份疑似MS感染的鸡病料进行MS分离鉴定,对分离的MS菌株进行基因分型,并对其vlhA基因5′端保守区域(76~421 nt)进行遗传进化分析。结果显示:共分离到29株MS菌株,除其中1株为E型外,其余28株均为L型;29株MS均处在一个大的进化分支,与国内流行菌株亲缘关系较近,与国外流行菌株亲缘关系较远。研究提示:近四年我国流行的MS菌株相对独立,各地流行菌株同源性较高。

滑液囊支原体活疫苗(MS-H株)在黄羽肉种鸡中的免疫效果探索

通过评估滑液囊支原体(Mycoplasma synovia,MS)MS-H株活疫苗在黄羽肉种鸡中的免疫效果,为MS在我国鸡群中的感染防控技术研究提供临床参考。该试验通过对6批次黄羽肉种鸡群在21和90日龄分别进行MS活疫苗(H株)免疫,定期测定血清MS抗体水平,并通过三合一方式采集上颚裂拭子检测MS-H株和MS野毒菌株在鸡群中的定殖率或感染率,评估疫苗免疫效果。试验结果表明:①通过血清MS抗体水平检测发现所有鸡群的鸡在1日龄呈现中等水平的MS母源抗体,平均滴度在3000~5000,随着日龄的增加在14、28、42日龄时MS母源抗体基本呈现阴性;而所有鸡群在56日龄时MS抗体陆续转变为阳性。②6批次鸡群中有2批次在42日龄首次检出野毒菌株,阳性率分别为100%、37.5%,其余4批次鸡群分别在70、70、84、112日龄开始检出野毒菌株,阳性率均在25%以下。③通过对MS-H株在鸡群中的持续检测发现6批鸡群在疫苗免疫后1周均检出了MS-H株,大部分鸡群在免疫后3~5周定殖率达到了最高,均超过了80%,部分鸡群的定殖率可达100%,且直到52周龄时MS-H株的检出率仍维持在62.5%~87.5%。可见,MS-H株活疫苗在黄羽肉种鸡中两次免疫,MS-H株可以较好的在鸡群中定殖,持续时间可达52周,且MS抗体水平适中,野毒感染率较低且不能在鸡群中发生大面积的水平传播。因此,MS-H株疫苗在鸡群中两次免疫其疫苗株在鸡群中定殖率较高且维持时间较长,可以阻止MS野毒在鸡群中的感染和水平传播,具有良好的免疫效果。

鸡滑液囊支原体对常用抗菌药流行病学临界值的建立

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是现在规模化禽养殖业中危害最大的支原体之一,同时也出现了严重的耐药性。为了解鸡滑液囊支原体对各种药物的耐药现状。本课题参考CLSI和EUCAST中制定流行病学/野生型临界值(epidemiological/wildtype cut-off values, ECOFFs/CO_(WT))的方法,通过查找国内外相关文献报道,收集汇总近5年不同地区、不同来源的MS对各种药物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)数据,应用肉眼观察法、ECOFFinder软件分析法和正态化耐药解释法(NRI)综合分析从而得到ECOFFs,随后计算相应的耐药率。结果显示,MS对泰乐菌素、替米考星、泰万菌素、多西环素、土霉素、金霉素、泰妙菌素、林可霉素、氟苯尼考和大观霉素的ECOFF值分别为1、0.5、0.5、2、4、2、2、2、8和4μg·mL^(-1)。在CLSI和EUCAST缺乏MS对各种抗菌药的敏感性折点下,本课题为临床合理用药,耐药性工作的开展,减少MS耐药性的产生以及治疗与防控提供了理论基础与科学依据。

鸡毒支原体和滑液囊支原体双重LFD-RPA快速检测方法的建立

【目的】鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节。通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法。【方法】基于MG的mgc2基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针,优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法,评价其灵敏度、特异性、稳定性,同时对120份临床样品进行检测。【结果】双重LFD-RPA检测方法在37℃下反应5-10min即可完成扩增,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1最佳引物配比为0.6∶1.4。MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46 copies/μL。用该方法与OIE推荐的PCR方法对120份样品进行检测,二者符合率为93.3%。【结论】MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增,其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好,无需使用任何仪器即可观察到结果,适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测。

4株滑液囊支原体分离株P80脂蛋白的基因克隆及序列分析

为研究滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)P80家族脂蛋白的功能及其异同,通过PCR方法从4株滑液囊支原体分离株中分别扩增P80-1,P80-2,P80-3蛋白的基因序列并进行测序,通过生物信息学方法对P80家族脂蛋白的蛋白序列进行分析,寻找保守结构域、抗原表位,并预测功能.结果表明,P80家族脂蛋白均为碱性亲水性稳定蛋白,在N端具有较强疏水性,只有P80-2蛋白具有跨膜螺旋区;P80家族脂蛋白信号肽的位置与疏水区结果相一致;3条P80蛋白具有12个相同的保守结构域及2~4个不同的结构域;有31~32个抗原表位;二级结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主;三级结构预测显示,P80-1蛋白具有ABC转运蛋白的功能,P80-2蛋白为周质结合蛋白Ⅱ型,P80-3蛋白具有细胞黏附功能.研究结果可为MS P80家族脂蛋白功能的深入研究以及MS致病机制、病原诊断和疫苗研制提供参考.

鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)-鸡滑液囊支原体四联灭活疫苗免疫效果研究

为探讨制备的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)-鸡滑液囊支原体四联灭活疫苗(以下简称新支流滑四联灭活疫苗)免疫效果,试验采用新城疫病毒(NDV)La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞,用易感鸡胚增殖传染性支气管炎病毒(IBV)M41株,H9亚型禽流感病毒(AIV)ML01株接种MDCK-sc悬浮细胞,用改良Frey氏培养基发酵培养鸡滑液囊支原体(MS)ML-MS1株,收获抗原液,制备新支流滑四联灭活疫苗,并对疫苗进行安全性和效力测定;以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量接种30日龄SPF鸡,免疫后7、14、21 d采血测定NDV HI和AIV(H9亚型)HI抗体,并于免疫后21 d进行NDV和AIV攻毒;30日龄SPF鸡首免H120株,免疫后21 d采血测定IBV HI抗体效价,并以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量进行二免,免疫后7、14、21、28 d采血测定IBV HI抗体;以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量接种30日龄SPF鸡,免疫后7、14、21、30 d采血测定MS ELISA抗体,并于免疫后30 d进行MS攻毒。结果显示:制备的新支流滑四联灭活疫苗安全性良好、效力合格;免疫后21 d NDV HI效价为6.6~8.8 log2,AIV HI效价为7.0~9.7 log2;免疫后28 d IBV HI效价为5.6~7.8 log2,且二免是首免的3.2~14.9倍;免疫后30 d MS ELISA效价为3 164~6 847;攻毒试验结果显示,0.05 mL/只剂量组对ML-MS1攻毒保护率为80%(8/10),其余组均为100%(10/10)保护。研究表明,新支流滑四联灭活疫苗对SPF鸡安全、有效,以0.1 mL/只剂量免疫SPF鸡可获得较好的免疫效果。