温阳通络方抗胶原诱导性关节炎小鼠滑膜新生血管形成的机制研究

目的探讨温阳通络方对抗胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠滑膜新生血管形成的作用机制。方法复制胶原诱导型关节炎小鼠,随机分为甲氨蝶呤组、模型组、空白对照组、温阳通络方高、中、低剂量组,每组5只。测量足趾容积,采用HE染色、免疫组化、Western blot检测滑膜组织中Ang-2、VEGF蛋白表达情况。结果造模前(0 d)、造模35 d,各组DBA/1小鼠足趾容积差异无统计学意义;造模48 d,各组足趾容积与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。空白组、甲氨蝶呤组、温阳通络方高、中、低剂量组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。空白组、模型组、温阳通络方低、中剂量组与甲氨蝶呤组比较,差异有统计学意义(P<0.01),温阳通络高剂量组与甲氨蝶呤组比较,差异无统计学意义。模型组滑膜组织HE染色提示有大量淋巴细胞浸润及滑膜细胞增生;甲氨蝶呤组、温阳通络方高、中、低剂量组仅有少量淋巴细胞,未见明显滑膜细胞增生。模型组小鼠滑膜组织中有大量Ang-2、VEGF蛋白表达,而甲氨蝶呤组、温阳通络方高、中、低剂量组中Ang-2、VEGF蛋白表达明显减少(P<0.01)。Western blot检测,空白组、甲氨蝶呤组、温阳通络方高、中、低剂量组Ang-2、VEGF蛋白表达水平均较模型组明显降低。结论温阳通络方能抗胶原诱导性关节炎小鼠滑膜组织新生血管形成,进而减轻滑膜炎症。

三七总皂苷联合雷公藤多苷对胶原诱导关节炎大鼠血清白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α表达及滑膜新生血管的影响

目的综合分析胶原诱导关节炎(CIA)大鼠应用三七总皂苷联合雷公藤多苷对其血清白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达及滑膜新生血管的影响。方法建立胶原诱导关节炎大鼠模型,将50只大鼠分为正常对照组(应用生理盐水灌胃方法,10只)、三七总皂苷组(应用三七总皂苷灌胃方法,10只)、联合组(应用三七总皂苷联合雷公藤多苷灌胃方法,10只)、雷公藤多苷组(应用雷公藤多苷灌胃方法,10只)、甲氨喋呤组(应用甲氨喋呤灌胃方法,10只);采用液相蛋白芯片技术检测胶原诱导关节炎大鼠的TNF-α、IL-1β表达水平和白细胞介素-6、血管内皮生长因子、单核细胞趋化蛋白-1的表达量。结果三七总皂苷组、联合组、雷公藤多苷组、甲氨喋呤组的TNF-α表达水平均高于正常对照大鼠组(P<0.05);联合组TNF-α表达水平低于三七总皂苷组、雷公藤多苷组以及甲氨喋呤组(P<0.05);三七总皂苷组、联合组、雷公藤多苷组、甲氨喋呤组的IL-1β表达水平均高于正常对照组(P<0.05);联合组IL-1β表达水平低于三七总皂苷组、雷公藤多苷组以及甲氨喋呤组(P<0.05);5组大鼠白细胞介素-6、血管内皮生长因子水平、单核细胞趋化蛋白-1的表达量比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论三七总皂苷联合雷公藤多苷成分配伍可以有效调节胶原诱导关节炎大鼠的IL-1β、TNF-α表达水平,抑制滑膜新生血管的生成。

基于VEGF/VEGFR2信号通路探究苗药铁筷子醇提物抗类风湿关节炎大鼠滑膜血管新生作用

目的本项目拟以“苗药铁筷子”为研究对象,研究其对胶原诱导型(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠抗炎活性及VEGF/VEGFR2/P38 MAPK通路的调控机制。方法将60只雌性Wistar大鼠,随机分为正常组、模型组、阳性药物组、铁筷子低、中、高剂量组,每组10只。将牛Ⅱ型胶原蛋白溶液注入大鼠尾部,复制大鼠模型,阳性药物组灌胃给予甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)2.0 mg/(kg·d),每隔1 d 1次;铁筷子低、中、高3个剂量组以铁筷子醇提取物灌胃0.25、0.5和1 g/(kg·d),每天1次;正常组、模型组均采用等量NaCl溶液灌胃;连续灌胃28 d。治疗过程中,观察各组大鼠一般状况,记录体重变化,测定大鼠足底厚度;治疗结束后取大鼠后肢,经Micro-CT检测骨质破坏程度、苏木素-伊红(HE)染色法进行关节滑膜的病理学研究,免疫组织化学染色观察滑膜新生血管数量,反转录聚合酶链反应法(qRT-PCR)在大鼠滑膜组织中检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-A、血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、肿瘤坏死因子(tumer necrosis factor,TNF)-α的mRNA水平,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测VEGF、VEGFR2、p-P38、p-AKT的表达,以探索苗药铁筷子治疗类风湿性关节炎的潜在作用机制。结果与正常组比较,模型组大鼠体重降低显著(P<0.01),足肿胀度明显增加(P<0.01),病理切片可见踝关节及后肢其他小关节滑膜组织明显增生、大量炎性细胞浸润,骨组织表面可见啃噬样病变,滑膜新生血管数量明显增多,Micro-CT显示明显骨质破坏、骨量百分比、骨小梁厚度、骨密度均显著下降,关节滑膜组织中VEGF-A、VEGFR2、TNF-αmRNA水平显著升高(P<0.01),VEGF-A、VEGFR2、p-P38、p-AKT蛋白表达量均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,铁筷子醇提物呈剂量依赖性改善上述情况,以铁筷子高剂量组效果最优,大鼠的体重显著升高(P<0.05),足肿胀度明显下降(P<0.05),滑膜组织病理学损伤及骨组织啃噬样病变情况明显好转,滑膜组织新生血管明显减少,VEGF-A、VEGFR2、TNF-αmRNA水平明显降低(P<0.01),VEGF-A、VEGFR2、p-P38、p-AKT蛋白表达量显著降低(P<0.01)。结论苗药铁筷子可能通过调节VEGF/VEGFR2信号通路减轻CIA大鼠关节炎性损伤,进而发挥治疗类风湿关节炎的作用。

中药治疗类风湿关节炎抗滑膜血管新生作用研究进展

类风湿关节炎(RA)是一种以慢性破坏性关节病变为主要特征的自身免疫性疾病。滑膜血管新生是RA发病过程中出现较早且至关重要的因素,以滑膜血管为靶标已成为治疗RA的新策略。中药治疗RA历史悠久,并显示出较好的抗RA作用。本文就近年中药抗滑膜血管新生作用的研究状况加以整理,为进一步深入研究中药抗RA作用提供参考。

抗类风湿性关节炎滑膜增生和滑膜血管新生中药的研究进展

类风湿性关节炎(RA)是一种病因复杂、病理表现以滑膜炎症、关节积液、骨侵蚀和滑膜血管异常增生形成血管翳为特征的慢性进行性自身免疫系统疾病,是世界性的难治病,受到各研究领域的广泛重视。中药复方或单体成分通过干预RA对滑膜组织的异常增殖、血管新生、关节软骨和免疫系统等方面的研究取得了一定进展,研究水平已达到分子水平。笔者就中药复方和单体成分在治疗实验性RA滑膜增生和滑膜血管新生作用的研究报道进行综述,为今后研究抗RA药物提供一定参考。

佐剂关节炎大鼠滑膜血管新生与VEGF/PI3K/AKT信号通路相关性研究

目的:研究佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜血管新生与血管内皮生长因子(VEGF)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝-苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路的相关性。方法:选取30只SD大鼠随机分为正常组和模型组各15只,将模型组大鼠采用弗氏完全佐剂注射致炎,建成AA大鼠模型,观察大鼠关节炎指数(AI)与足跖肿胀度(E),采用免疫组化法测定滑膜微血管密度MVD,电镜下观察血管内皮细胞超微结构,采用ELISA法测定血清白细胞介素-1(IL-1)水平,实时荧光定量PCR检测滑膜组织缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、VEGF水平,采用WB法检测滑膜组织PI3K、AKT蛋白的表达。结果:与正常组相比,模型组大鼠E、AI增高,滑膜组织MVD、VEGF、HIF-1α、PI3K、AKT及血清IL-1水平增加(P﹤0.01)。相关性分析显示PI3K与足趾肿胀度、关节炎指数、IL-1、HIF-1α、VEGF呈正相关(P﹤0.05);AKT与足趾肿胀度、IL-1、VEGF呈正相关(P﹤0.01);VEGF与MVD、HIF-1α呈正相关(P﹤0.01);HIF-1α与关节炎指数、MVD、PI3K呈正相关(P﹤0.05)。结论:VEGF/PI3K/AKT信号通路参与AA大鼠滑膜血管新生过程,VEGF介导PI3K/AKT信号通路的过表达可能是AA大鼠滑膜血管新生的作用机制之一。

基于HIF-1α/CXCL12/CXCR4/VEGF信号通路探索中药复方调控CIA大鼠滑膜血管新生的机制

目的 探究清热活血方调控胶原诱导关节炎大鼠缺氧诱导的滑膜血管新生作用机制。方法 24只清洁级SD雌性大鼠随机分为正常组、模型组、清热活血方组、甲氨蝶呤组。注射牛Ⅱ型胶原乳剂造模,造模成功后各组大鼠分别给予相应药物灌胃,治疗过程中间隔测量大鼠体质量、足趾容积,进行关节炎指数评分,用ELISA法检测血清白细胞介素(interleukin,IL)-18、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、趋化因子配体[chemokine (C-X-C motif) ligand,CXCL]12水平,Western blot法检测滑膜组织低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α、趋化因子受体[chemokine (C-X-C motif) receptor,CXCR]4、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达量。结果 与正常组相比,模型组大鼠关节红肿变形明显,关节炎指数明显增加;同时血清中TNF-α、IL-18和CXCL12水平升高(P<0.01),滑膜组织HIF-1α、CXCR4、VEGF蛋白表达显著降低(P<0.01),关节病理显示滑膜内可见炎性细胞浸润,滑膜组织增生,滑膜血管增生的扩张及新生。与模型组相比,清热活血方组及甲氨蝶呤组能够明显降低足趾容积,减轻大鼠的关节肿胀情况,关节病理切片显示清热活血方可以抑制关节内滑膜组织的增生,延缓滑膜血管扩张及新生。清热活血方及甲氨蝶呤能够降低大鼠血清中IL-18,TNF-α、CXCL12水平(P<0.01),并且能明显降低HIF-1α、CXCR4、VEGF表达水平(P<0.01),两组作用情况相仿(P>0.05)。结论 清热活血方能够明显减轻足趾肿胀情况,降低模型大鼠炎症水平,抑制相关蛋白的表达,从而改善关节缺氧的情况,减缓血管的扩张及新生,其机制可能是清热活血方通过调控HIF-1α/CXCL12/CXCR4/VEGF通路抑制模型大鼠的血管新生。

新风胶囊对佐剂性关节炎大鼠关节滑膜组织中VEGF-AmRNA表达的影响

目的观察新风胶囊对佐剂关节炎大鼠关节滑膜组织血管内皮细胞生长因子-A(vascular endothelial growth factor,VEGF-A)mRNA表达的影响,探讨新风胶囊对类风湿性关节炎滑膜血管新生的作用机制。方法将50只Wistar大鼠随机分成5组:正常对照组、模型对照组、甲氨蝶呤组、雷公藤多苷组、新风胶囊组,每组10只。除正常对照组外,其余各组均采用弗氏完全佐剂建立佐剂关节炎大鼠模型。造模成功后,各治疗组给予相应药物灌胃,连续30 d,采用SP免疫组化法滑膜微血管密度(microvessel density,MVD)计数,采用PCR法检测各组大鼠滑膜组织VEGF-A mRNA的表达。结果与正常对照组比较,模型组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数升高,滑膜组织MVD及VEGF-A mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,新风胶囊组MVD及VEGF-A mRNA表达水平均显著降低(P<0.01),与新风胶囊组比较,甲氨蝶呤组MVD升高(P<0.05)。结论新风胶囊可降低大鼠滑膜组织VEGF-A mRNA的表达,从而发挥抑制滑膜血管新生的作用。

类风湿性关节炎滑膜血管新生与中医药

检索PubMed和中国知网全文数据库,对1988年至2011年发表的200余篇相关文献进行筛选和分析,从类风湿性关节炎(RA)血管新生与滑膜炎症的关系、滑膜血管新生的调控和研究模型以及中医药对其干预的实验研究进展等方面归纳总结。RA滑膜血管新生是一个由促血管生成和抑血管生成介质调控的复杂过程,机制尚不清楚,但血管新生由滑膜炎症所介导,二者相互交织、协同作用是重要原因;RA研究学者常将血管生成的体内外模型应用于滑膜血管新生的发生机制及药物的干预影响方面的研究,近年有学者将RA滑膜移植入整体动物体内以建立可供动态观察滑膜血管新生过程的模型,如非侵蚀性的RA滑膜血管皮瓣窗和SCID-HuRAg嵌合体模型等;中医将RA归属于"痹证"和"络病"范畴,有学者认为RA络病的实质是滑膜血管增生,实验研究也显示具祛风胜湿、活血化瘀、虫类搜风等"通络开痹"功效的中药和复方有较好的抗RA和滑膜血管新生作用。滑膜血管新生在RA发生、发展的病理过程中处于核心位置,但目前尚没有理想的治疗策略。中医药在干预RA滑膜血管新生方面有一定的特色并显示良好的作用趋势。

雷公藤多苷片抑制实验性类风湿关节炎血管新生的作用研究

为了了解雷公藤多苷片对体外血管内皮细胞(HUVEC)管腔形成能力的影响以及对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠关节滑膜血管新生的作用,该研究拟采用20μg?L^-1血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导HUVEC体外模型,观察0.1,1,10 mg?L^-1雷公藤多苷片作用7 h后对HUVEC管腔形成和管腔分支点数目影响的情况;另外,通过建立CIA大鼠模型,以9,18,36 mg?kg^-1?d^-1雷公藤多苷片连续给药42 d,采用HE染色法观察CIA大鼠关节滑膜中血管形态和密度,免疫组化和免疫荧光双染法检测滑膜中血管内皮细胞标志物血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)和α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的表达情况,免疫组化和Western blot法观察滑膜组织中低氧诱导因子1α(HIF1α)和血管紧张素(Ang1)的表达水平。结果显示,1,10 mg?L^-1雷公藤多苷片可显著降低VEGF诱导的管腔分支点数,0.1,1,10 mg?L^-1雷公藤多苷片可显著降低VEGF诱导的管腔形成面积和长度;9,18,36 mg?kg^-1?d^-1雷公藤多苷片能显著降低CIA大鼠炎症关节的滑膜微小血管和血管密度,抑制CD31阳性表达量、CD31^+/αSMA-不成熟血管和总血管阳性表达,同时18,36 mg?kg^-1?d^-1雷公藤多苷片负向调节滑膜中HIF1α和Ang1的含量。提示了雷公藤多苷片对CIA大鼠关节滑膜组织的血管新生和体外HUVEC的管腔形成有抑制作用,且这一作用可能与其调节炎症关节滑膜中失衡的HIF1α/Ang1轴有关。

从VEGF/VEGFR2/PI3K/AKT信号轴所介导的血管新生调控网络探索白虎加桂枝汤干预类风湿关节炎热证的作用及其机制

出自《金匮要略》的热痹经方白虎加桂枝汤(BHGZD)临床治疗类风湿关节炎(RA)的疗效确切。但针对该方的作用机制研究多围绕调节机体炎症反应和免疫功能等方面,对其抑制滑膜血管新生的药效与机制尚未见报道。本研究采用转录组学数据挖掘、生物网络分析与“动物-细胞”实验验证相整合的研究策略,探讨BHGZD干预RA热证滑膜血管过度新生病理环节的潜能和分子机制。动物福利和实验过程均遵循中国中医科学院实验动物伦理委员会的规定。网络分析结果表明, BHGZD干预RA热证的候选网络靶标显著参与多条血管新生调节相关通路。其中,血管内皮生长因子A-血管内皮生长因子受体2 (VEGFA-VEGFR2)信号通路包含多个BHGZD候选网络靶标,如VEGF、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、丝-苏氨酸激酶(AKT)等。进一步的实验验证结果表明, BHGZD可有效降低佐剂诱导性关节炎热证大鼠膝关节滑膜中血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)的表达,血清中VEGF的水平、内皮性一氧化氮合酶(eNOS)的活性,关节组织中磷酸化血管内皮生长因子受体2 (p-VEGFR2)、p-PI3K以及p-AKT蛋白的表达水平,升高血清中内皮抑素(endostatin)的水平,并显著减少HUVEC、MH7A细胞的迁移和侵袭活性,及HUVEC细胞的管腔形成活性。综上所述, BHGZD具有缓解RA热证滑膜血管过度新生的潜能,其作用机制可能与干预VEGF/VEGFR2/PI3K/AKT信号通路相关。