基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路介导滑膜细胞焦亡探讨宣痹通络膏对急性痛风性关节炎的作用机制

目的:探究宣痹通络膏对急性痛风性关节炎(AGA)大鼠滑膜细胞焦亡的作用及机制。方法:将40只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、宣痹通络膏组(36 g/kg)、秋水仙碱组(阳性对照药,0.3 mg/kg),每组各10只。除对照组大鼠外,其余各组大鼠均采取踝关节腔内注射尿酸钠构建AGA模型,并于造模成功后当天对大鼠进行分组灌胃给药干预,1次/d,连续3 d。分别于4、24、48 h测定各组大鼠踝关节肿胀指数;苏木素-伊红(HE)染色观察各组大鼠踝关节滑膜组织病理学变化;TUNEL染色检测滑膜细胞焦亡指数;免疫组化及酶联免疫吸附法(ELISA)检测滑膜组织及血清IL-1β和IL-18表达;免疫荧光及Western blotting检测滑膜组织TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠踝关节肿胀指数明显升高(P<0.05),滑膜组织明显增厚,并伴有炎性细胞大量浸润,滑膜细胞焦亡指数明显增加(P<0.05),且滑膜组织IL-1β、IL-18蛋白及TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路蛋白(TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1)表达均明显升高(P<0.05),血清IL-1β和IL-18水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比,宣痹通络膏组和秋水仙碱组大鼠踝关节肿胀指数明显降低(P<0.05),滑膜组织损伤减轻,滑膜细胞焦亡指数明显降低(P<0.05),且滑膜组织IL-1β、IL-18蛋白及TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路蛋白表达均明显下调(P<0.05),血清IL-1β和IL-18水平明显降低(P<0.05)。结论:宣痹通络膏可能通过调节TLR4/NF-κB/NLRP3通路,抑制滑膜细胞焦亡,从而发挥抗AGA的作用。

机械敏感性通道蛋白对膝骨关节炎滑膜巨噬细胞焦亡的调控效应分析

目的:探讨机械敏感性通道蛋白Piezo1对膝骨关节炎细胞焦亡的调控效应。方法:选取5只SPF级雄性SD大鼠,提取腹腔巨噬细胞,分为空白对照组、应力拉伸组及应力拉伸+Piezo1抑制剂组。使用FX-5000T细胞牵张拉伸应力加载系统以6个循环/min的周期性频率对BioFlex板内巨噬细胞进行表面干预。Western Blot检测Caspase-1,Caspase-1 p10,GSDMD蛋白表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞上清IL-1β及IL-18含量;Hoechst33342/PI细胞双染免疫荧光检测巨噬细胞膜的完整性;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测巨噬细胞培养上清乳酸脱氢酶含量;荧光倒置显微镜观察线粒体活性氧(ROS)荧光强度。结果:应力拉伸组Caspase-1,Caspase-1 p10及GSDMD蛋白表达水平较空白对照组增加(P<0.05),而应力拉伸+Piezo1抑制剂组较应力拉伸组有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);此外,应力拉伸组较空白对照组培养上清中IL-1β和IL-18含量显著上升,差异有统计学意义(P<0.05),应力拉伸+Piezo1抑制剂组较应力拉伸组含量显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);Ho/PI双染发现应力拉伸组细胞膜遭到破坏,碘化丙啶(PI)染色呈现红色荧光,应力拉伸+Piezo1抑制剂组细胞膜较为完整,PI不能染色或者染色较少;同时,应力拉伸组上清液中LDH含量显著上升,差异有统计学意义(P<0.05);应力拉伸+抑制剂LDH含量较应力拉伸组则显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);最后ROS荧光检测发现应力拉伸组产生大量红色荧光,而应力拉伸+抑制剂组荧光强度较低。结论:异常机械应力可通过Piezo1离子通道,加剧滑膜巨噬细胞焦亡及推动膝骨关节炎的进程。