刚地弓形虫滑行相关蛋白的研究进展

顶复门寄生虫入侵宿主细胞的能力是其生存和致病的关键。刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是顶复门的一种专性细胞内寄生虫,无论其滑行、入侵或逸出感染细胞,都必须依靠被称为肌-动球蛋白马达(actomyosin motor,AMM)的装置提供动力。AMM主要由肌球蛋白A、1条肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC1)和2条必需轻链(essential light chain,ELC)1、2以及滑行相关蛋白(gliding-associated protein,GAP)组成。目前已经发现的GAP家族包括GAP45、GAP50、GAP80、GAP70和GAP40,它们是构成驱动寄生虫运动的滑行体的重要成分。滑行体是一个存在于寄生虫质膜与内膜复合物之间的以肌-动球蛋白为基础的动力装置。本文概述了目前对GAP构建与功能的理解以及弓形虫运动的分子基础,同时对GAP作为弓形虫病疫苗候选抗原分子作了展望。

刚地弓形虫滑行相关蛋白45的克隆、表达与免疫反应性检测

目的克隆、原核表达刚地弓形虫滑行相关蛋白45(TgGAP45)基因,检测重组蛋白rTgGAP45的免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。根据TgGAP45基因全长编码序列的开放阅读框设计引物,PCR扩增TgGAP45基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgGAP45转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,分别以抗His标签抗体、人抗弓形虫血清或小鼠抗弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白免疫反应性。结果刚地弓形虫GAP45基因的cDNA开放式阅读框全长为738 bp,PCR扩增结果显示,在750 bp处有一条特异性扩增条带(带His标签),与预期大小相符。菌落PCR、双酶切以及测序结果均表明重组质粒pET-30a(+)-TgGAP45构建成功。SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约35000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析结果显示,诱导表达的蛋白为带His标签的重组蛋白,可分别被His标签抗体、人抗弓形虫血清和小鼠抗弓形虫STAg血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgGAP45基因片段可在原核表达系统中高效可溶性表达,该重组蛋白rTgGAP45具有免疫反应性。