刚地弓形虫滑行相关蛋白的研究进展

顶复门寄生虫入侵宿主细胞的能力是其生存和致病的关键。刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是顶复门的一种专性细胞内寄生虫,无论其滑行、入侵或逸出感染细胞,都必须依靠被称为肌-动球蛋白马达(actomyosin motor,AMM)的装置提供动力。AMM主要由肌球蛋白A、1条肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC1)和2条必需轻链(essential light chain,ELC)1、2以及滑行相关蛋白(gliding-associated protein,GAP)组成。目前已经发现的GAP家族包括GAP45、GAP50、GAP80、GAP70和GAP40,它们是构成驱动寄生虫运动的滑行体的重要成分。滑行体是一个存在于寄生虫质膜与内膜复合物之间的以肌-动球蛋白为基础的动力装置。本文概述了目前对GAP构建与功能的理解以及弓形虫运动的分子基础,同时对GAP作为弓形虫病疫苗候选抗原分子作了展望。

刚地弓形虫滑行相关蛋白45的克隆、表达与免疫反应性检测

目的克隆、原核表达刚地弓形虫滑行相关蛋白45(TgGAP45)基因,检测重组蛋白rTgGAP45的免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。根据TgGAP45基因全长编码序列的开放阅读框设计引物,PCR扩增TgGAP45基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgGAP45转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,分别以抗His标签抗体、人抗弓形虫血清或小鼠抗弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白免疫反应性。结果刚地弓形虫GAP45基因的cDNA开放式阅读框全长为738 bp,PCR扩增结果显示,在750 bp处有一条特异性扩增条带(带His标签),与预期大小相符。菌落PCR、双酶切以及测序结果均表明重组质粒pET-30a(+)-TgGAP45构建成功。SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约35000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析结果显示,诱导表达的蛋白为带His标签的重组蛋白,可分别被His标签抗体、人抗弓形虫血清和小鼠抗弓形虫STAg血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgGAP45基因片段可在原核表达系统中高效可溶性表达,该重组蛋白rTgGAP45具有免疫反应性。

基于机器学习筛选脑胶质瘤1p/19q共缺失特征基因及其在预测1p/19q共缺失中的作用

目的基于机器学习方法筛选脑胶质瘤1p/19q共缺失特征基因, 并探讨其在预测1p/19q共缺失中的作用。方法回顾性分析中国脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)、癌症基因组图谱计划(TCGA)数据库中脑胶质瘤患者的肿瘤组织转录组测序数据及临床信息, 将CGGA693的数据作为试验组(508例), CGGA325(298例)和TCGA(545例)的数据作为验证组。采用单因素Cox回归方法和机器学习方法分别筛选试验组中1p/19q共缺失与1p/19q非共缺失者与免疫相关的差异表达基因。2种筛选方法共同具有的候选基因定义为1p/19q共缺失特征基因(以下简称特征基因)。在2个验证组中验证特征基因在1p/19q共缺失与非共缺失者间的差异。绘制受试者工作特征曲线(ROC), 计算试验组和验证组中特征基因预测1p/19q共缺失的曲线下面积(AUC);采用Kaplan-Meier生存分析法分析AUC值较大的特征基因与预后的关系。在试验组, 采用logistic回归分析方法, 基于特征基因及临床信息构建不同的1p/19q共缺失预测模型;采用AUC、赤池信息量准则、净重新分类指数、综合判别改善指数、决策曲线分析法综合评估每个模型的预测效能。另纳入南京医科大学附属常州第二人民医院神经外科行手术切除的22例脑胶质瘤标本, 采用实时荧光定量PCR法检测1P/19q类缺失者与非共缺失者特征基因mRNA的表达水平。结果试验组中共筛选出6个特征基因, 分别为血管生成素样蛋白2(ANGPTL2)、骨形成蛋白2(BMP2)、骨形成蛋白8b(BMP8b)、成纤维细胞生长因子11(FGF11)、组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及滑行蛋白α(TXLNA)。2个验证组中, 6个特征基因在1p/19q共缺失与非共缺失组中的表达差异均有统计学意义(均P<0.001)。试验组和验证组的ROC显示, HDAC1、TXLNA基因预测1p/19q共缺失的AUC值均>0.9;生存分析显示, HDAC1、TXLNA基因低表达者的总生存期均长于高表达者, 差异均有统计学意义(均P<0.001)。共建立3个预测1p/19q共缺失模型:模型A (变量:TXLNA), 模型B (变量:TXLNA+HDAC1), 模型C[变量:TXLNA+HDAC1+年龄+世界卫生组织(WHO)分级+异柠檬酸脱氢酶突变] 。多个预测效能评估结果显示, 模型A对1p/19q共缺失的预测能力略逊于模型B、C, 但差异不大。1p/19q共缺失者TXLNA的mRNA表达水平低于非共缺失者(P<0.01)。结论 TXLNA是胶质瘤1p/19q共缺失特征基因, 其预测1p/19q共缺失的效能较高。