跨越式滚环扩增(SRCA)结合金纳米粒子可视化检测食品中的沙门氏菌

沙门氏菌是引起全球人类腹泻病的主要病因,严重危害人畜健康。传统检测方法耗时长,步骤繁琐,因此开展快速简便灵敏的可视化检测方法,具有重要意义。本文设计能与靶序列结合的探针,将其与金纳米粒子(AuNPs)结合。经跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)扩增的靶序列,高温变性后成为单链,其与金纳米粒子上的探针结合后,释放出金纳米粒子,在MgSO_(4)的作用下,聚集呈现肉眼可见的蓝色,判定为阳性,阴性为紫色。依此,建立一种简便、快捷、灵敏的可视化检测方法。结果表明:该方法特异性良好,能够区分8株沙门氏菌阳性与8株非沙门氏菌阴性。可视化检测的灵敏度为5.5×10^(0)CFU/mL。将牛奶样品人工污染沙门氏菌,检出限为3.7×10^(0)CFU/mL。在50份实际样品检测中,与GB 4789.4-2016方法进行比较,该方法敏感性为100.00%,特异性为97.87%,符合率达到98.00%。本文建立的SRCA-AuNPs可视化检测方法,具有较高的应用价值,结果肉眼可见,适合于现场可视化检测和基层单位使用。

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆

将跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)与荧光技术相结合,建立一种实时荧光SRCA技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法。对DNA提取方案进行评估,以大米的特异性基因(PDL、SPS、rbcL、GOS9)为靶序列设计引物,筛选适宜的引物,优化扩增反应条件结合荧光技术建立检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法,并对该方法进行评价。结果表明,建立的实时荧光SRCA方法检测大米DNA的灵敏度为8.45×10~1fg/μL,经特异性评价证实其特异性良好,在人工模拟掺伪检测中建立掺伪比例的对数与Ct值的线性关系,线性方程为y=6.618x+7.651(R~2=0.993),可准确检出蜂蜜中低至1%的大米糖浆成分。该方法灵敏度高,检出限低,能够快速、准确检测蜂蜜掺伪大米糖浆,为蜂蜜掺伪的快速检测提供了新思路。

跨越式滚环等温扩增试剂盒检测沙门氏菌的研究

沙门氏菌可引起食源性疾病,严重危害食品安全和人类健康。因此,开发新的检测方法尤为重要。本研究基于自主研发的新型核酸扩增方法--跨越式滚环等温扩增,研制了检测沙门氏菌的试剂盒,并对该试剂盒相关性能进行评估。结果显示,试剂盒检测沙门氏菌的特异性良好,灵敏度为4.1×10^(1)CFU·mL^(-1),有效期可达90 d,表明该试剂盒可靠、灵敏、稳定,可满足食品中沙门氏菌快速检测的需求。

基于靶标诱导滚环扩增的无标记适配体生物传感器快速检测赭曲霉毒素A

该文构建一种基于靶标诱导滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)的无标记适配体快速检测赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)生物传感器。该生物传感器探针由RCA引物与OTA适配体两部分组成,在OTA存在的环境中,OTA适配体特异性识别靶标,探针结构被打开,RCA引物与环状DNA模板(circular DNA template,CT)结合开启RCA反应,加入核酸染料SYBR Gold产生荧光信号。此生物传感器具有较高的特异性,检测限为6.6×10^(-2)nmol/L,线性检测范围为6.6×10^(-2)~660 nmol/L,可用于具体的分析检测。此生物传感器无需复杂化学修饰且操作简单,在食品安全检测中具有良好的应用前景。

不对称PCR结合滚环扩增信号放大技术检测牛肉中单增李斯特菌

建立一种不对称聚合酶链式反应结合滚环扩增信号放大(Rolling circle amplification,RCA)的技术,对牛肉中单增李斯特菌进行快速灵敏检测。通过改变上下游引物的浓度,扩增得到一条带有通用序列的单链DNA,进而引发RCA反应,产生大量的G-四链体序列,硫黄素T嵌入G-四链体序列中产生荧光信号,从而实现对单增李斯特菌的检测。在最优的条件下,本研究所建立的方法对单增李斯特菌在PBS中的检测限为3.6×101 CFU/mL;在加标的牛肉中,其检测限达到了3.6×102 CFU/g。本研究所建立的方法可实现单增李斯特菌的快速检测,通过改变特异性的引物,该方法也可用于其他食源性致病菌的检测,具有较高的推广应用价值。

滚环扩增技术在电化学生物传感器中的应用

在电化学生物传感器的设计中,信号放大是实验环节中的重要步骤,特别是对靶标进行灵敏度分析时更是不可或缺。滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)能够在短时间内得到大量产物,并在电极表面进行扩增或孵育,然后通过一定的设计使电化学信号被快速放大。RCA技术具有高度的灵敏性和特异性,电化学生物传感器则可提供实时、快速、低成本的检测。为了更好的了解RCA,介绍了RCA环化的基本原理、RCA种类,重点总结了RCA与电化学生物传感器结合的不同技术类型及应用,并对未来相关研究领域的发展趋势进行了展望,旨在为RCA技术在电化学生物传感器中的进一步发展和应用提供参考。

滚环扩增结合DNA纳米传感器超灵敏检测HIV整合酶方法的建立

目的以H I V整合酶(integrase,I N)为特异性靶标,利用滚环扩增(rollingcircle amplification,RCA)技术结合DNA纳米传感器建立一种HIV IN等温扩增检测方法(rolling-circle-enhanced-INactivity-detection,REIAD)。方法提取纯化的重组HIV IN或包装HIV颗粒,以HIV IN活性为靶标,设计IN识别的附着位点(attachment site,att)长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)和双链DNA环,与DNA纳米传感器检测技术结合,将LTR固定于载玻片表面并催化其末端插入双链DNA环生成一个有切口的DNA环,进行界面RCA扩增和荧光标记探针检测,建立REIAD。通过检测梯度稀释HIV IN和包装HIV颗粒,评价检测方法的敏感性,确定检测限;通过梯度稀释小鼠白血病病毒(murine leukemia virus,MLV)和HIV IN抑制剂雷特格韦作用,评价检测方法的特异性。通过对梯度稀释HIV IN中加入HEK293全细胞提取物及10%胎牛血清细胞培养基检测,评价患者血浆样本检测的可行性。结果REIAD方法在37℃、整合50min、滚环扩增30min条件下完成梯度稀释HIV IN及包装HIV颗粒的检测,具有良好的敏感性,重组HIV IN和包装HIV颗粒的最低检出限可达15fmol和2TU/μl,与MLV无交叉反应,具有良好的特异性。结论本研究建立的REIAD检测方法具有敏感性高、特异性好,操作简便,平台要求低等优点,有望为HIV早期检测提供一种新的方法。

基于T-T错配和滚环扩增检测水中的汞离子

汞离子(Hg^(2+))是一种重要的重金属污染物,快速准确的检测食品中的Hg^(2+)对保障食品安全具有重要意义。本研究利用Hg^(2+)能够介导T-T错配的特性,结合滚环扩增信号放大(Rolling circle amplification,RCA)技术,建立了一种信号关闭型荧光法用于检测水中的Hg^(2+)。在RCA引物浓度为50 nmoL/L,反应时间为1 h时,该方法对水中Hg^(2+)的检测限达0.5 nmoL/L,加标回收率在94.9%~122.0%之间。本研究所建立的方法可实现Hg^(2+)快速检测,具有较大的推广应用前景。

滚环扩增原理及其在医药领域的应用

滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展,介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。

柑桔溃疡病菌滚环扩增检测体系的建立

根据柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)独有的蛋白基因序列和锁式探针公共连接序列分别设计特异性的锁式探针及其扩增引物,优化系列反应条件,建立了特异性的柑桔溃疡病菌滚环扩增体系。初步检测结果表明该体系能够特异性地检出Xac的菌体细胞及其DNA,而检测不出供试的其它植物病原细菌和柑桔叶面常见的多种附生细菌;对Xac靶片段克隆质粒DNA的检测灵敏度为102copy/μL,对Xac菌悬液的检测灵敏度为20cfu/μL,比常规PCR的检测灵敏度稍高。用滚环扩增技术和常规PCR技术对田间采集的实际样品进行了检测,两种方法的检测结果没有显著差异(P>0.01)。由于锁式探针的公共连接序列对扩增的条件要求一致,本体系的建立可以为植物病原微生物多靶标检测和病害检疫检验提供新的技术支撑。

滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA检测中的应用

目的建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法。方法以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象。根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBVcccDNA的正、负链结合。在Phi29DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较。结果成功建立了HBVcccDNA全序列的RCA方法,最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列。27例患者中,18例患者的肝组织cccDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变。结论滚环扩增方法对肝组织HBVcccDNA的检测具有较好的灵敏度。该方法的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义。

基于竞争触发滚环扩增的荧光适配体传感器高灵敏检测凝血酶

利用目标蛋白、适体探针、挂锁探针和与适体探针匹配的互补序列之间的竞争反应,发展了一种基于滚环扩增的高灵敏荧光适配体传感器。在不含目标蛋白时,互补序列由于与适体探针杂交形成双链,因此不能与挂锁探针杂交以触发连接-滚环放大反应。相反,有目标蛋白存在时,由于目标蛋白与适体探针结合,使得互补序列被置换下来,从而可以与挂锁探针杂交。在DNA连接酶的作用下,挂锁探针被进一步环化并在Phi 29 DNA聚合酶的作用下发生滚环扩增反应。扩增产物含有许多能与分子信标检测探针环状部分杂交的重复序列,从而分子信标被打开产生荧光信号。对互补序列的长度及挂锁探针的浓度进行了考察。在优化的实验条件下,本传感系统可以实现对的凝血酶高灵敏检测,线性范围为0.067~32 nmol/L,检出限为0.03 nmol/L（约90 amol目标分子）。通过设计不同的适体探针和相关核酸序列,本传感系统可以作为一种通用型方法用于其它目标物的分析。

一种DNA扩增的新技术:利用热稳定的Bst DNA聚合酶驱动跨越式滚环等温扩增反应

Bst DNA聚合酶具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,在体外DNA等温扩增反应中起重要作用.本文利用Bst DNA聚合酶的5'→3'聚合酶、核苷酸(末端)转移酶及链置换酶活性发展了一种新的体外环式DNA扩增技术跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA).在SRCA反应中,Bst DNA聚合酶以上游引物P1为模板合成其互补链RcP1,并和P1形成双链DNA;之后,Bst DNA聚合酶用其核苷酸转移酶活性在其P1的3'末端沿5'→3'方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸(dNMP)m序列,即DNA的合成反应跨越了RcP1与下游引物P2之间的缺口;然后,以下游引物P2为模板形成互补序列(RcP2);接着,Bst DNA聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到RcP2的3'末端,形成(dNMP)n序列.继而,Bst DNA聚合酶以RcP1为模板,继续催化聚合反应合成互补新链,并通过其链置换酶活性替换P1;如此往复,形成[P1-(dNMP)m-RcP2-(dNMP)n-…]序列.本文通过电泳、酶切、测序等方法对扩增产物进行分析,演绎出上述扩增过程,并就工作原理进行了讨论.该反应可能对开发等温扩增技术检测微生物有一定助益,也为解释环介导等温扩增技术中假阳性反应和滚环等温扩增反应中的背景信号提供了线索.

可视化跨越式滚环等温扩增技术检测食品中沙门氏菌

建立一种新型的核酸体外等温扩增方法--可视化跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)检测沙门氏菌。根据沙门氏菌stn基因序列设计引物,进行特异性验证。测定该技术的灵敏度以及人工污染鸡肉样品的检出限。通过检测多种实际食品样品,评价SRCA方法的敏感性、特异性和符合率。研究结果表明:所有沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,说明引物特异性良好。SRCA方法检测沙门氏菌DNA的灵敏度为5.6×10^0 fg/μL,检出限为3.8×10^1 CFU/mL;PCR方法的灵敏度为5.6×10^2 fg/μL,检出限为3.8×10^3 CFU/mL。该方法检测30个实际样品的检出率为13.33%,并与GB 4789.4-2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%,96.30%和96.67%。结论:可视化跨越式滚环等温扩增技术具有操作简便,特异性强,灵敏度高,检出限低,检测成本低,对试验设备要求低等优点,适用于基层单位对食品中沙门氏菌的快速检测。

超分支滚环扩增法检测小麦矮腥黑穗菌

【目的】建立小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)的超分支滚环扩增(hyper-branched rolling cycle amplification,HRCA)检测体系,为小麦矮腥黑穗病的鉴定以及早期诊断提供了一种新的稳定、可靠的检测技术。【方法】锁式探针包含一个公共连接序列和在探针两端与靶DNA序列互补的2个序列。根据TCK的差异序列设计锁式探针两端序列,以此为基础建立了TCK超分支滚环扩增反应体系。以优化的HRCA反应条件为基础,确定检测体系的特异性和灵敏度。比较HRCA体系和常规PCR体系的性能,并利用这2种体系对来自中国出入检验检疫局截获的51个小麦样品进行了验证检测。【结果】HRCA体系能专一地检出小麦矮腥黑穗菌的DNA靶带,而TCT、TCL等近源种及健康小麦样品都不能扩增。HRCA检测TCK靶序列质粒DNA的下限为1fg·μl-1,检测基因组DNA的下限为10pg·μl-1,检测灵敏度比常规PCR检测体系高10倍。HRCA检测体系具有很好的特异性、灵敏度和准确性,更适合于TCK的检测及鉴定。【结论】稳定、灵敏、特异的小麦矮腥黑穗菌的HRCA检测体系的建立,为小麦矮腥黑穗病的早期诊断及其近源种的多靶标检测提供了同步检测技术。

小肠结肠炎耶尔森氏菌滚环扩增检测方法的建立

根据滚环扩增的原理设计引物、锁式探针以及反应体系,建立和优化了滚环扩增(Rolling Cycle Amplification,RCA)检测体系,构建可快速检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌的RCA检测方法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立的RCA检测方法,具有很好的特异性,灵敏度为1.7×102CFU/mL,高于普通PCR方法。小肠结肠炎耶尔森氏菌RCA检测方法具有较高的灵敏度和特异性,适合在细菌快速检测方面应用。

利用滚环扩增技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因单碱基突变

目的应用滚环扩增(rolling circle amplification)技术建立对结核分枝杆菌耐药基因单碱基突变的快速检测方法。方法以结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因为研究对象,设计针对该基因常见突变位点的锁式探针。通过对突变型模板、野生型模板、非结核分枝杆菌基因序列模板及不同比例的突变型模板和野生型模板混合样本的检测,研究本实验方法的特异性和灵敏度。建立特异性地检测rpoB基因单碱基突变的滚环扩增方法。通过对临床样本的检测并与测序结果比较,评价该方法的临床应用价值。结果通过优化反应条件,应用滚环扩增技术能特异性的检测出结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的单碱基突变。通过对含有不同比例突变型模板的混合样本检测,最低能检测出1%突变型/野生型模板的样本。80株临床样本的检测与测序结果一致。结论滚环扩增技术特异性高、灵敏度高,无需特殊昂贵仪器且简单易操作,能够快速有效的检测出耐药结核的单碱基突变,是具有临床应用前景的方法。

超分支滚环扩增法检测传染性脾肾坏死病毒

用超分支滚环扩增法检出传染性脾肾坏死病毒。超分支滚环扩增法包括锁式探针的连接及超分支滚环扩增法扩增两部分,通过研究锁式探针的最佳连接体系和连接条件,并进行超分支滚环扩增法反应条件的优化,得出的本研究最适反应条件为:锁式探针在T4 DNA连接酶作用下37℃连接20 min,接下来的超分支滚环扩增法在Bst DNA聚合酶大片段作用下61℃反应40 min,即能够实现靶序列的有效检出。灵敏度试验表明,超分支滚环扩增法所能检测到的最低模板量接近1 copy。在4种病毒中进行的特异性试验表明,本方法能够保证对传染性脾肾坏死病的特异性检测。

滚环DNA扩增技术及其应用

滚环扩增技术是一种等温信号扩增方法,DNA可在很短时间内实现指数扩增,因此,可用于痕量分子的检测。目前,该技术既可以扩增环状DNA、RNA,也可以扩增线性DNA,甚至全基因组DNA。目前,该技术主要用于全基因组扩增、核酸测序、单核苷酸多态性以及DNA芯片、蛋白质芯片分析等广泛领域。

超分支滚环扩增技术快速检测结核分枝杆菌感染的临床应用价值

目的建立超分支滚环扩增技术(HRCA)对结核分枝杆菌的快速检测平台。方法对60例肺结核病人,38例非结核对照组和20例健康人的痰标本进行检测;同时对鸟分枝杆菌等非结核分枝杆菌检测以评价该平台的特异性。结果 HR-CA对H37Rv IS6110基因的检测灵敏度达到740 aM,检测H37Rv菌悬液的灵敏度为200 cfu/ml。鸟分枝杆菌等非结核分枝杆菌的检测结果均为阴性。60例肺结核病人检测灵敏度(73.33%,44/60)与定量PCR相近(78.33%,47/60),显著高于涂片法(41.67%,25/60),差异具有统计学意义。结论超分支滚环扩增技术是一种简单实用,结果可靠和具有较强临床应用前景的结核菌检测技术。