逆转录病毒滴度测定新方法的实验研究

[目的]研究一种简便、快速的能获取较高病毒滴度的体外培养方法。[方法]用质脂体转移法将逆转录病毒载体pLXIn转染到包装细胞PA317中,用G418筛选出抗性克隆,扩大培养,再收集上清,并测定病毒滴度。比较不同方法产生病毒的多少,为提高病毒滴度而进一步感染靶细胞奠定良好的实验基础。[结果]改良后的新方法(低温32℃、无CO2条件以及反复冻融法)较常规方法(37℃、5%CO2)可提高病毒滴度至少10倍。PTs,PTas和PLXIn组病毒颗粒数分别提高到1.3×105CFU/mL、1.2×105CFU/mL、1.5×105CFU/mL。[结论]逆转录病毒滴度测定新方法简便、快捷,能获取较高病毒滴度。

含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装及滴度测定

目的:包装含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒并测定其滴度,用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMC)中提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRⅠ单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序;将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析;用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32等4种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并测定其滴度。结果:克隆出人CCR5Delta32基因,并构建了含该基因的重组慢病毒载体,经293T细胞包装后产生5×105 TU/mL的重组慢病毒。结论:高滴度含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装,为进一步的AIDS基因治疗研究奠定了基础。

慢病毒RNAi载体的制备及滴度测定方法的建立

目的构建可用于神经系统基因功能研究和基因治疗的慢病毒RNAi载体系统,并建立一种方便、快捷的慢病毒滴度测定方法。方法三质粒系统：PLK0.1-puro、△8.2、水疱性口炎病毒G糖蛋白（VSV-G）共转染293T细胞,产生慢病毒RNAi载体颗粒,超速冷冻离心浓缩;将病毒颗粒进行系列稀释后感染Eca9706细胞,采用嘌呤霉素最小致死量筛选病毒感染细胞的方法,进行慢病毒滴度测定。结果完成了慢病毒RNAi载体的包装及浓缩,确定了嘌呤霉素对Eca9706细胞的最小致死浓度为2.7μg/ml,并应用该浓度测得病毒颗粒的滴度为10^7TU/ml。结论成功构建了一种慢病毒RNAi载体，并建立了一种可行的慢病毒滴度测定方法。

乙型肝炎病毒(adr亚型)重组逆转录病毒包装及滴度测定

目的包装乙型肝炎病毒(adr亚型)重组逆转录病毒并进行滴度测定,为下一步构建乙型肝炎病毒(adr亚型)转基因小鼠奠定基础。方法将乙型肝炎病毒(adr)全基因组插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了乙型肝炎(adr)重组逆转录病毒载体,鉴定正反向后,脂质体转染PA317包装细胞,G418抗性压力下进行筛选得到阳性细胞克隆,扩大培养后进行滴度测定,选取产毒率高细胞克隆株,然后扩大培养、浓缩,进行滴度测定。结果分别获得HBV(adr)全基因组正向和反向插入的重组逆转录病毒。正连重组逆转录病毒载体经PA317细胞包装,经筛选、浓缩后滴度为106CFU/m l,反连重组逆转录病毒载体经PA317细胞包装,经筛选、浓缩后滴度为105CFU/m l。结论PA317细胞包装了含乙型肝炎病毒(adr)全基因组的重组逆转录病毒。

抗DNA酶B滴度测定在风湿性心脏病诊断中的价值

目的 探讨抗 DNA酶 B检测用于风湿性心脏病诊断的价值。方法 检测 43例风湿性心脏病伴活动性风湿热 ,39例风湿性心脏病不伴风湿热活动和 40例非风湿性心脏病 (对照组 )病人血清的抗 DNA酶 B抗体 ,并进行对比。结果 风湿性心脏病伴活动性风湿热组 ,风湿性心脏病不伴风湿热组和对照组抗 DNA酶 B阳性率分别为81.4% ,2 0 .1%和 5 % ,与对照组比较 ,前两组的 P值分别为 <0 .0 0 1和 <0 .0 5。结论 抗 DNA酶

吉林市小学生抗链菌脱氧核糖核酸酶B滴度测定

目的：研究吉林市１０￣１１岁小学生链球菌的感染状况。方法：用ＡＤＮａｓｅＢ微量法对吉林市１０￣１１岁城乡小学生做抗链菌脱氧核糖核酸酶Ｂ滴度测定。结果：城市小学生ＤＮＡ酶Ｂ抗体平均几何滴度为５６ｕ／ｍｌ，农村为５９ｕ／ｍｌ。城市与农村的测定结果无明显差异。结论：由于此种抗体的滴度可以标准化，因此推荐ＡＤＮａｓｅＢ作为除ＡＳＯ外应测定的第二抗体。

腺病毒滴度不同测定方法比较

目的将目前测定腺病毒滴度常用的OD260法、荧光定量PCR法、绿色荧光蛋白标记法、壳蛋白免疫法、细胞病变(CPE)法进行比较研究,分析和讨论各种方法的优缺点。方法 4种重组腺病毒(Ad-G-AT2R-EGFP、Ad–CMV-EGFP、Ad-mif-shRNA-EGFP和Ad-CBA-GFP)扩增、纯化后,同时分别用OD260值法、荧光定量PCR法、绿色荧光蛋白标记法、壳蛋白免疫法及CPE法测定病毒滴度,并以壳蛋白免疫法测定结果作为标准,对各种方法所得结果进行比较研究。结果绿色荧光蛋白标记法、CPE法与壳蛋白免疫法同时测定4种腺病毒滴度,其结果无统计学差异(P>0.1)。荧光定量PCR法测定值明显高于壳蛋白免疫法(P<0.05),但与该法测定结果间存在良好的相关性(r=0.965),约为壳蛋白免疫法所测得结果的10倍。OD260法测得结果与壳蛋白免疫法测得结果间则无相关性。结论绿色荧光蛋白标记法与壳蛋白免疫法是测定腺病毒感染性滴度最为快速有效的方法,其结果客观可靠,能真实地反映病毒的实际感染力。荧光定量PCR法测定结果反映的是完整的病毒颗粒数,能够间接反映病毒的感染力,且该方法操作简单,耗时短,同样有较高的实用性。

经典方法与LaSRT法测定绿色荧光蛋白标记重组病毒滴度的研究

目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl带有GFP 标记基因的病毒感染,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以流式细胞仪检测细胞eGFP+率。病毒滴度(TU/ml)=(2×105×细胞eGFP+率)/病毒原液体积。(2)LaSRT法:NIH3T3 细胞以5 000/孔接种于96 孔板,12 h后更换成完全培养液90 μl/孔,以8孔为一组,第1 孔中加入病毒液10 μl,此后每孔依次10∶1 倍比稀释,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以浓度自高到低的方向,在荧光倒置显微镜下确定计量孔(第n孔),计数孔中的阳性细胞数m。病毒滴度(TU/ml)=m×10n+1。(3)对7批病毒以LaSRT法研究,探讨冻存/复苏过程对重组病毒滴度的影响。结果经典方法测定的重组病毒滴度为(1.54±0.38)×106 TU/ml,LaSRT法测定的病毒滴度为(1.33±0.57)×106 TU/ml,两者无统计学差异(P>0.05)。LaSRT法可以大批量、快速地测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度。单次冻存/复苏后的病毒滴度为冻存前的(18.1±9.9)%(n=7)。结论LaSRT法和经典方法测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度,结果无统计学差异;

绿色荧光标记重组人偏肺病毒空斑形成滴度测定方法的建立

目的 建立用于绿色荧光标记的重组人偏肺病毒（GFP-rhMPV）空斑形成滴度测定方法.方法 基因组中插入绿色荧光蛋白基因的hMPV全序列cDNA质粒和主要蛋白质表达质粒转入细胞293T后获得感染性重组hMPV.GFP-rhMPV在Vero-E6细胞中连续传代提升病毒滴度并保存.将等倍稀释的重组病毒液接种常规制备的Vero-E6细胞单层,用含或不含胰酶的低熔点琼脂精凝胶覆盖细胞,孵育一定时间后,采用荧光显微镜下计数荧光空斑数和抗原抗体蓝斑形成法计算病毒滴度.结果 感染后3 d,荧光显微镜下GFP-rhMPV可在低熔点琼脂糖凝胶覆盖层下形成分界较为清晰的绿色荧光集落,接种后3 d荧光空斑相对独立,便于计数.蓝斑形成法在感染后第5天蓝斑较大,易观察.此前拯救获得的GFP-rhMPV在宿主细胞Vero-E6中的复制滴度可达1×10^6 PFU以上.结论 成功建立了GFP-rhMPV的空斑形成实验滴度定量检测方法,为hMPV的致病机制、防治手段研究奠定了基础.

鞭角华扁叶蜂保幼激素滴度的动态

用高效液相色谱法 (HPLC)测定了鞭角华扁叶蜂 (Chinolydaflagellicornis)末龄幼虫及滞育预蛹血淋巴中保幼激素 Ⅲ (JHⅢ )的滴度。结果表明 ,末龄幼虫血淋巴中JHⅢ的滴度虽呈明显下降趋势 ,但仍保持较高的水平(17ng·mL- 1 ) ;滞育预蛹血淋巴中JHⅢ的滴度达 2 0ng·mL- 1 左右 ,而在化蛹前一天则可达 30ng·mL- 1 以上。表明JH对鞭角华扁叶蜂预蛹滞育起调节作用。

胰酶浓度对轮状病毒蚀斑形成的影响

轮状病毒属于呼肠孤病毒属（reovirus），是世界范围内导致婴幼儿急性肠炎的主要病原。由于轮状病毒存在众多的血清型，且其基因可重排产生新的基因型，所以在研究过程中保持毒株的纯净十分重要。病毒粒子单克隆的筛选是病毒分子遗传和疫苗毒株研究中一项基本和基础的工作，其中蚀斑实验是非常理想的方法，同时也是轮状病毒滴度测定较为客观和准确的方法。但是，轮状病毒蚀斑形成受毒株、细胞的影响，相关试剂特别是胰酶（pancreatin）的浓度，对实验的稳定性及结果判定影响较大。为此，笔者观察了不同浓度胰酶对轮状病毒蚀斑形成的影响，对胰酶浓度进行优选，以期建立稳定的轮状病毒蚀斑实验方法。

人骨形态发生蛋白-7重组腺病毒载体的构建

目的为了研究人骨形态发生蛋白-7(hBMP7)导入骨缺损模型中的治疗作用,构建重组腺病毒载体。方法将hBMP7基因全长定向克隆入穿梭质粒pACCMV-plpA,构建pACCMV/rhBMP7穿梭质粒,应用磷酸钙-DNA共沉法将穿梭质粒及包装质粒PJM17共转染293细胞,经细胞内同源重组后,构建骨形态发生蛋白-7重组腺病毒Ad pAC-CMV/rhBMP7。结果成功构建了重组质粒pACCMV/rhBMP7,经293细胞包装后,扩增纯化测定病毒滴度为1×1011pfu/mL。结论成功构建人骨形态发生蛋白-7重组腺病毒Ad pACCMV/rhBMP7,为骨缺损、骨不连的基因治疗奠定了基础。

人分化抑制因子3重组腺病毒的制备及鉴定

目的构建人细胞分化抑制因子3(Id3)重组腺病毒载体,制备并鉴定人Id3重组腺病毒,为研究Id3基因在细胞中的表达及其对细胞功能的影响奠定基础。方法以pUC57-Id3为模板扩增人Id3基因,克隆到质粒pUC18中,pUC18-Id3经EcoR I和HindⅢ双酶切补平之后与载体pAxCAwtit连接,构建重组粘粒载体pAxCAwtit-Id3,包装试剂盒包装重组粘粒,转染大肠埃希菌,鉴定正确后大量制备重组pAxCAwtit-Id3,经酶切线性化后,用脂质体法转染HEK293A细胞,包装成重组腺病毒Ad-Id3,制备高滴度的重组腺病毒Ad-Id3,利用TCID50法计算重组腺病毒滴度,经RT-PCR及western blot检测Id3基因的表达。结果Id3基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.8×1010PFU/ml,用RT-PCR检测到Id3基因的转录产物,westernblot检测到Id3在A549细胞中的高水平表达。结论成功构建Ad-Id3重组腺病毒载体,并在A549细胞中得到高效表达。

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。

Construction of a lentiviral vector for RNA interference of human VIM gene and its silencing effect in pancreatic cancer cells

目的将为人的活力基因的 RNA 干扰(RNAi ) 构造 lentiviral 表示向量；并且在胰腺的癌症房间线 Panc-1 估计它的基因 silencing 效果。短发卡 RNA (shRNA ) 定序的三人的活力基因用联机的可得到的一个软件和一对被设计的方法来自文件。在合成以后并且退火，四双 stranded oligonucleotides (dsOligo ) 被克隆进 pGCL-GFP/U6 原生质标志，它被聚合酶链反应(PCR ) 和 DNA 定序分析随后证实。实时 PCR 并且西方弄污被用来在 293T 房间屏蔽有效 pGCL-GFP-shRNA 原生质标志，然后，最有效的被挤进有包装材料 pHelper 的 lentiviral 的 recombinant lentivirus Lv-VIM-shRNA 1.0 并且 pHelper 2.0 在 293T 房间。lentivirus 的 titer 被 hole-by-dilution titer 试金决定。在 Panc-1 房间的 Lv-VIM-shRNA 的 silencing 效果被即时 PCR 验证并且西方弄污。结果有效 Lv-VIM-shRNA 成功地被构造。lentivirus 的 titer 在 2 ×上被决定 10 9 TU/mL。活力 mRNA 和 vimentin 的表情是在感染 Lv-VIM-shRNA 的 Panc-1 房间的 down-regluated。有效 Lv-VIM-shRNA 能在 vitro 在 Panc-1 房间禁止活力基因的表示的结论，它为在发信号的小径调查活力基因的角色提供一个工具在胰腺的癌症和寻找的新治疗学的目标的 tumorigenesis 和前进包含了。