河北省丝孢菌研究 Ⅲ、漆斑菌属(Myrothecium Tode:Fr.)的四个种

本文报道了寄生或腐生于植物上的漆斑菌属(Myrothecium Tode: Fr.)真菌4个种。其中白毛漆斑菌(M. leueotrichum(Peck)Tulloch)为中国新记录种;另外还报道了露湿漆斑菌(M. roridum Tode: Fr.)的几种新寄主植物。文中有种的鉴定特征描述和分种检索表。

真菌电化学修复除草剂污染土壤:降解动力学探索

【目的】微生物燃料电池(microbial fuel cell,MFC)在去除污染物的同时产出电能,是一种颇有前景的生态修复手段。构建真菌强化MFC装置,比较电动力(EK)、真菌、MFC修复除草剂污染土壤效果及优缺点,探索MFC在有机污染物修复中的应用潜力。【方法】设计了一种添加真菌进行生物强化的MFC,并用EK、真菌、MFC三种方法修复两种除草剂污染的灭菌土壤。经筛选和驯化的疣孢漆斑菌和踝节菌菌株用于后两种方法,研究真菌强化对MFC去除除草剂的影响。测量土壤pH、电导率、除草剂去除率,MFC产电性能,用气相色谱-质谱鉴定两种除草剂的降解产物。【结果】EK修复中,添加模拟电解液、碳纤维条、加电10 V的处理组7 d后氯氟吡啶酯(F)和高效氟吡甲禾灵(H)去除率分别为71%和38%。真菌、MFC处理F的最大去除率达到100%。对比踝节菌,疣孢漆斑菌对两种除草剂的降解性能更好,疣孢漆斑菌、踝节菌单菌构建的MFC对H的去除率分别为62.5%和24.1%。F降解产物为氟氯吡啶酸,H降解产物为乙酸大茴香酯,推测了降解路径和降解动力学。三种方法降解F以及EK降解H均符合动力学一级反应,而真菌和MFC降解H符合二级反应。【结论】对比EK、真菌修复,MFC修复效果更好,该方法可以较快地修复土壤又无需额外供电,是一种经济有效的自持式修复策略。

漆斑菌Myrothecium sp.IMER1液体和固体发酵产胆红素氧化酶分析

为了提高漆斑菌Myrothecium sp.IMER1的胆红素氧化酶(bilirubin oxidase,BOX)产量,分析了其液体和固体发酵产酶的特性。首先分析了该菌株液体和固体发酵产BOX的时间变化曲线,对其所产的胞外酶进行了活性电泳,进一步分析了其液体产酶的模型和宏观动力学内容。结果表明,菌株IMER1在液体发酵中第5天的产BOX酶量最大,其固体发酵产酶量最大时间也是在第5天,但是,其固体发酵能持续高产BOX。从BOX的底物活性显色中可知,在固体和液体发酵的粗酶液中都能检测到BOX,并且没有同工酶出现;而BOX生物合成模式为中期合成型,通过数据计算和模拟得出了产酶动力学方程。

疣孢漆斑菌(Myrothecium Verrucaria)J-1胆红素氧化酶的纯化及性质初步研究

从中国土样中筛选到一株能产生胆红素氧化酶的微生物(Myrothecium Verrucaria)J-1,培养后,分离纯化,最后经QAE—Sephadex A50柱层析,得到胆红素氧化酶比活为207.65 U/A 280nm,总产率为22.3％。纯酶紫外吸收峰为278 nm,凝胶电泳为单一色带。分子量估计为52000。它能迅速、特异地氧化胆红素为胆绿素,并进一步氧化成目前还不清楚的紫色化合物。最佳作用pH为7.0,最佳作用温度为40℃。

疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria GH-01漆酶的纯化和酶学性质研究

疣孢漆斑菌具有生长周期短,分泌漆酶酶活高等特点。利用已分离得到的疣孢漆斑菌GH-01(Myrothecium verrucaria GH-01)发酵产生粗酶液。进而通过分级沉淀、透析和层析的方法对漆酶粗酶液进行纯化。SDS-PAGE和Native-PAGE结果表明纯化可获得具有漆酶活性的单体蛋白。酶学性质研究表明,该漆酶催化最适温度为40℃,在底物ABTS存在条件下的最适p H值为4.0,且在低温及碱性条件具有较好的稳定性。此外通过漆酶对4大类染料脱色能力的研究,发现该漆酶对偶氮类的橙黄Ⅰ和蒽醌类的茜素红脱色有较好的脱色效果,反应1 h脱色率达80%以上;对三苯甲烷类的碱性品红脱色能力较弱,脱色率只能达到20%左右;脱色率最差的是杂环类的亚甲基蓝。在含10 U漆酶的体系中,对50 mg/L的染料降解效果相对最佳。

露湿漆斑菌胆红素氧化酶的分离纯化及其性质

露湿漆斑菌产生的胆红素氧化酶粗酶液通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-100纯化,得到纯化152.54倍胆红素氧化酶,得率19.14%;用PAGE检测为单一条带,活性电泳证实该单一蛋白质组分为胆红素氧化酶,SDS-PAGE证明该酶的相对分子质量为64000。该酶最适反应温度为55℃,以胆红素为底物时最适pH值为7.5,而以ABTS为底物时最适pH值为4,该酶在pH 3-8之间都能够检测到酶活。以胆红素为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为552.06μmol/L和38.91μmol/（L.min）;而以ABTSA为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为631.84μmol/L和12.79μmol/（L.min）。

产漆酶半知真菌Myrothecium verrucaria NF-08菌株的分离及产酶研究

【目的】采集凉水国家级自然保护区原始森林土壤样品,分离产漆酶真菌并优化产酶条件,旨在开发产漆酶半知真菌种质资源,提高漆酶产量,为微生物漆酶扩大生产提供菌种资源和条件参数。【方法】以木质素磺酸钠为唯一碳源的无机盐培养基为富集培养基,在愈创木酚-PDA选择性平板上分离产漆酶真菌。利用ABTS[2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和SGZ[4-羟基-3,5-二甲氧基-苯甲醛连氮,即丁香醛联氮]显色反应初筛和摇瓶发酵复筛。确定供试菌株后,利用形态观察结合r DNA-ITS序列分析技术,将菌株鉴定至种。以ABTS法测定供试菌发酵液漆酶活性,以Lowry法测定发酵液总蛋白含量。在考察供试菌株生长、产酶及胞外蛋白总量动态变化基础上,通过单因素试验,研究碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、培养基起始p H、装液量、接种量及底物诱导对菌株产漆酶的影响,获得菌株产酶最适培养基组分和培养条件参数。【结果】获得1株发酵周期短、初始酶活高的产酶菌株NF-08。结合形态学特征与r DNA-ITS序列分析结果,鉴定菌株NF-08属于为半知菌亚门疣孢漆斑菌。该菌株在液体发酵培养基中产漆酶活性与菌丝生长和胞外蛋白总量基本同步,发酵第6天达到酶活峰值9.28 U·m L-1。疣孢漆斑菌NF-08产酶最佳碳、氮源分别为4.0%葡萄糖和3.5%蛋白胨,培养基初始p H7.0。最适装液量60 m L·(250 m L)-1,最适接种量4%,最适培养温度和摇床转速分别为30℃和140 r·min-1。没食子酸、阿魏酸和单宁酸显著诱导疣孢漆斑菌NF-08漆酶活性的产生,以没食子酸效果最好。经过培养基组分和培养条件优化以及底物诱导,疣孢漆斑菌NF-08产酶水平达到16.82 U·m L-1,比优化前提高了81.25%。【结论】建立环境样品中产漆酶真菌的分离、纯化及筛选方法,获得了一株发酵周期短、产漆酶活力高的半知真菌疣孢漆斑菌NF-08。该菌株经单因素试验产酶条件优化效果明显,酶活水平提高显著,可为微生物发酵产漆酶提供新的菌株资源,在微生物发酵漆酶工业生产中具有应用潜力。后续对疣孢漆斑菌NF-08漆酶产生、性质及基因表达调控的深入研究,将有助于了解漆酶在半知真菌生活史中的作用及生态学功能,同时拓展半知真菌漆酶的应用领域。

疣孢漆斑菌发酵液正丁醇部位化学成分研究

目的:对疣孢漆斑菌发酵液正丁醇部位进行化学成分研究。方法:采用各种提取分离纯化技术进行化学成分分离,运用波谱技术进行结构鉴定。结果:从疣孢漆斑菌发酵液正丁醇部位分离鉴定了14个化合物,分别鉴定为:分别为cyclo-(Pro-Phe)(1)、cyclo-(4-OH-Pro-Phe)(2)、cyclo-(4-OH-Pro-Leu)(3)、cyclo-(Ala-Pro)(4)、cyclo-(4-methyl-Pro-9-propyl-Gly)(5)、cyclo-(Pro-Gly)(6)、cyclo-(Phe-Gly)(7)、cyclo-(Leu-Leu)(8)、N-乙酰色胺(9)、N-(2-苯乙基)乙酰胺(10)、N-(2-羟基苯乙基)乙酰胺(11)、N-(4-羟基苯乙基)乙酰胺(12)、尿嘧啶(13)、胸腺嘧啶(14)。结论:所有化合物均为首次从该真菌中分离得到。

疣孢漆斑菌发酵液的化学成分及其农药活性的研究

对一株羌活内生真菌—疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)的发酵液进行化学成分研究,采用乙酸乙酯萃取,硅胶柱色谱和制备型HPLC等色谱手段分离、纯化,从中分离得到14个单体化合物。通过理化性质与波谱数据分析,分别鉴定为:疣孢菌素B(1)、8-乙酰基漆斑菌素H(2)、疣孢菌素M(3)、疣孢菌素J(4)、漆斑菌素D(5)、乙酰基疣孢菌素L(6)、异漆斑菌素E(7)、漆斑菌素E(8)、漆斑菌素H(9)、漆斑菌素A(10)、乙酰基漆斑菌素E(11)、Isotrichoverrin A(12)、Isotrichoverrin B(13)、疣孢菌素A(14)。其中化合物2、6、7为首次从该种真菌中分离得到。并对14个化合物进行农药活性测试,结果表明化合物10 ppm对拟南芥有显著的生长抑制作用,32 ppm对早熟禾有生长抑制作用,1000 ppm对绿棉铃虫的致死率大于70%,具有良好的除草和杀虫活性。这为进一步开发疣孢漆斑菌作为生物除草剂和杀虫剂提供理论依据。

广藿香内生真菌露湿漆斑菌菌丝体化学成分研究

目的：研究药用植物广藿香内生真菌露湿漆斑菌（ Myrothecium roridum）菌丝体的化学成分。方法采用正相硅胶柱层析、C18反相硅胶柱层析、sephadex LH-20凝胶柱层析以及薄层层析等色谱方法进行分离纯化，通过波谱数据分析结合文献对照对化合物结构进行鉴定。结果从广藿香内生真菌露湿漆斑菌菌丝体中分离并鉴定出5个化合物，分别为啤酒甾醇（1）、麦角甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2）、吡咯烷酮（3）、大黄酚（4）、尿嘧啶核苷（5）。结论化合物1~4均为首次从该属真菌中分离得到。

金属离子对漆斑菌产胆红素氧化酶的影响

比较了漆斑菌在8种液体培养基中胆红素氧化酶(BOX)产量,发现马铃薯液体培养基(PDB)是最适宜漆斑菌产BOX的培养基。研究了8种常见金属离子对漆斑菌产酶的影响,结果表明钠离子、铜离子可以明显促进BOX产量提高,铜离子效果最强,随着铜离子浓度增加,BOX酶产量可进一步提高,但高浓度的铜离子(1mmol.L-1)会抑制酶产量增加。

响应面法对漆斑菌液体发酵产胆红素氧化酶条件的优化

对漆斑菌(Myrothecium sp.IMER1)菌株液体发酵产胆红素氧化酶的条件进行了优化。采用单因素试验筛选出最适碳源为葡萄糖,氮源为硝酸铵,p H为7,温度为28℃和最有效促进产酶的金属离子为Cu2+。在此基础上,利用Plackett-Burman设计对影响产酶因素的效应进行评价,筛选出具有显著影响的3个因素葡萄糖、p H和温度。用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,得出p H、温度和葡萄糖分别为5.7、28℃、8 g/L时,优化后液体发酵液中胆红素氧化酶活力提高到0.627 U/m L,比未优化前的酶活力0.214 U/m L提高了近2倍,结果表明单因素与响应面结合法可优化菌株IMER1液体发酵产胆红素氧化酶的条件。

露湿漆斑菌胆红素氧化酶的鉴定

通过胆红素平板溶圈活性实验和聚丙烯酰胺活性电泳鉴定出露湿漆斑菌(MTR)为产胆红素氧化酶的菌株,通过活化菌种、摸索最佳发酵条件和加入诱导剂等方法来提高酶活,通过回收电泳、SDS-PAGE和等电聚焦初步分析得知酶的相对分子质量和等电点,为进一步的分离纯化奠定基础.

主要营养和环境因素对疣孢漆斑菌X-16菌株产孢的影响

营养条件和环境因素影响疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)的产孢量,对其进行研究能为疣孢漆斑菌的发酵提供理论支持。采用产孢量测定了不同碳氮比、碳氮源、碳浓度、温度、pH及光照对寄生根结线虫的疣孢漆斑菌X-16菌株产孢量的影响。结果表明,X-16菌株对碳源、氮源等营养的利用存在显著差异;X-16菌株产孢量以可溶性淀粉和硝酸钠最高,产孢量分别为7.87×108,1.027×109个/m L;C/N是60∶1时,产孢量最高;碳浓度为1～2 mol/L时最有利于平板产孢;X-16菌株在30～32℃时产孢量最高;适宜产孢的pH值为6.5;24 h光照有利于产孢。建议生产中可根据实际发酵情况选择最佳营养和环境条件。

漆斑菌发酵产胆红素氧化酶及其对酸性靛蓝脱色的研究

[目的]提高漆斑菌（Myrothecium sp.IMER1）产胆红素氧化酶产量,并研究其酶液对酸性靛蓝脱色性能。[方法]筛选合适的产酶培养基,研究外加碳源、温度、pH值等条件对产酶量的影响。提取粗酶液并对酸性靛蓝进行了脱色研究,用紫外-可见分光光度计扫描其在200~800 nm波长的变化。[结果]漆斑菌在PDB培养基上生长良好且产酶量最大;当以PDB培养基为基本培养基时,葡萄糖是其产酶的最适外加碳源,该菌最适产酶的温度和pH值分别是28℃和7.0。该酶在2 h内对酸性靛蓝脱色率可达到82%,酸性靛蓝降解液的扫描光谱图证实了染料分子的结构受到了破坏。[结论]试验结果为提高胆红素氧化酶产量提供了试验依据,证实了该酶在印染废水的脱色净化处理中具有潜在的应用前景。

广西地不容内生真菌疣孢漆斑菌DBR-11的抑菌活性

为了研究广西地不容内生真菌的抑菌活性,从广西地不容块根中分离纯化出18株内生真菌,采用拮抗试验测定了其对10种植物病原真菌的抑制活性,发现疣孢漆斑菌DBR-11对多数供试菌有很好的抑制活性。进一步测定了DBR-11菌株发酵产物的抑菌活性,发现发酵产物的乙酸乙酯萃取物对病原菌的抑制活性较高,质量浓度为5 g/L时,对10种植物病原真菌的抑菌率均在90%以上,有效中浓度（EC50）为0.007 2~0.446 5 g/L,其中对烟草黑胫病菌的毒力最高,EC50值为0.007 2 g/L;发酵产物的乙酸乙酯萃取物质量浓度为2 g/L时,72 h对15种供试动物病原菌中的7种能完全抑制,最低抑制浓度（MIC）为0.062 5~0.25 g/L,其中对痢疾志贺氏菌的抑制活性最高,MIC值为0.062 5 g/L。DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物有广谱的抗菌活性,具有潜在的应用价值。

黑孢漆斑菌漆酶活性及培养条件的优化

在ABTS法检测漆酶酶活性的基础上对黑孢漆斑菌的生长条件进行摸索.采用生长曲线分析,正交多因素分析及单因素分析对初始酸碱度,培养时间,接种量,菌龄,摇床转速及光照条件进行研究.结果表明:最佳培养条件为初始pH5.5,接种量7.5%,菌龄9天,摇床转速160 r/min,自然光照,培养9天.

产杀虫抗菌单端孢霉烯族毒素海绵真菌Myrothecium verrucaria Hmp-F73的筛选和鉴定

从98株分离自大连海域繁茂膜海绵Hymeniacidon perleve共附生的真菌中,筛选得到具有较强杀虫抗菌活性的丝状真菌Hmp-F73。96孔板卤虫生物检测(brine shrimp assay,BSA)结果显示,该菌株发酵滤液甲醇提取物浓度为0.25μg.mL-1时,卤虫校正死亡率为100%;甲醇提取物经硅胶柱层析洗脱得到7个馏分,其中馏分3浓度为400μg.mL-1时对甜菜夜蛾具明显抑制取食活性,拒食率达到85.25%;1mg.mL-1的馏分6对玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani抑菌圈直径达9.25mm。经色谱柱层析分离纯化得到4个杀虫抗菌活性化合物,氢核磁数据显示这些化合物均属于12,13-环氧单端孢霉烯族化合物。通过形态、培养特征及ITS1-5.8S-ITS2序列分析,将该菌株鉴定为疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria。

产漆酶疣孢漆斑菌Ws2-6原生质体制备条件的研究

通过对酶的种类、酶的组合、酶液浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂等因素的研究获得了制备疣孢漆斑菌原生质体的有效条件。采用浓度为0.7mol/L氯化钠为渗透压稳定剂,在pH6的磷酸缓冲体系中,以15mg/mL溶壁酶、5mg/mL纤维素酶R-10和10mg/mL蜗牛酶的混合酶液处理培养18h的菌丝体,30℃、80r/min振荡酶解6h,原生质体产生量达到最大值为7.83×106个/mL。此外,对原生质体释放的跟踪观察发现,疣孢漆斑菌原生质体释放有顶端、侧端释放2种方式。

漆斑菌中单端孢霉烯化合物及衍生物的细胞毒活性

从漆斑菌中分离得到了5个单端孢霉烯族化合物,并确定了其平面结构;选取其中获得量比较大的化合物进行结构改造,得到4个新化合物;分别对这9个化合物进行了抗菌和细胞毒活性测试.结果表明,化合物1结构中C12和C13位的环氧环打开后,重新与C2位形成新的四元环氧环或对C2'位的羟基进行酰基保护后,化合物的细胞毒活性下降.