单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体基因ORF真核表达载体的构建及表达

目的构建单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体基因ORF片段真核表达载体,并在Vero细胞中进行表达。方法用PCR方法从已成功构建的pVAX-LAT重组质粒中扩增潜伏相关转录体基因ORF片段,克隆到pcDNA6/myc-his B质粒中,构建pcDNA-ORF重组质粒,双酶切及测序鉴定其正确性。以脂质体法瞬时转染Vero细胞,并用RT-PCR和Western blot检测其表达。结果双酶切及测序表明ORF片段大小及序列均正确,RT-PCR及Western blot显示重组质粒在Vero细胞中得到了表达。结论成功构建了pcDNA-ORF重组质粒,并可在Vero细胞内有效表达。

单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达

背景:单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1真核表达载体的构建可以为研究单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1在病毒潜伏复发中的功能奠定基础。目的:构建含存单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1的真核表达载体,并通过转染非洲绿猴肾细胞(Vero),验证载体的体外表达情况。方法:根据单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1基因序列设计一对引物,以单纯疱疹病毒Ⅱ型333标准株基因组为模板PCR法扩增出开放读码框1基因,克隆至真核表达载体上,并进行酶切鉴定以及测序;利用X-fect转染试剂盒将重组质粒pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1转染vero细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达,并用荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达。结果与结论:开放读码框1基因的体外扩增目的片段为741bp,所构建的真核表达载体pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1经双酶切鉴定,与预期大小一致,测序结果与NCBI收录的开放读码框1基因序列一致;重组质粒pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1转染vero细胞后,RT-PCR验证有目的基因的转录,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达。表明成功构建pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1真核表达载体,并且实现其在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的表达。

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体开放读码框3对Vero细胞凋亡的影响

目的研究单纯疱疹病毒2型（HSV-2）潜伏相关转录体（LAT）开放读码框3（ORF3）对顺铂诱导的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）凋亡的影响。方法构建重组质粒pEGPF—ORF3，并转染Vero细胞，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）验证目的基因的表达。顺铂诱导Vero细胞凋亡，通过荧光显微镜观察凋亡小体，Giemsa染色检测细胞核形态，噻唑蓝法（MTr法）检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。实验结果采用SPSSl3．0进行分析，各组间两两比较采用单因素方差分析和t检验。结果成功克隆HSV-2333株ORF3基因，构建pEGFP—ORF3真核表达载体，RT—PCR验证该真核表达载体能在Vero细胞中高效表达。转染pEGFP—ORF3的Vero细胞经顺铂诱导凋亡后Giemsa染色，显示胞核蓝染，胞质淡浅，细胞形态正常。M．rr法分析显示，细胞增殖在转染pEGFP—ORF3组（2．56±0．21）与未经任何处理的正常对照组（2．66±0．13）比较，差异无统计学意义（P〉0．05），但高于顺铂诱导凋亡的正常对照组（1．65±0．11）和pEGFP—C2组（1．56±0．18），差异均有统计学意义（P〈0．05）；流式细胞仪分析细胞凋亡率，转染pEGFP—ORF3组（4．03％±1．04％）与正常对照组（2．13％±0．09％）比较，差异无统计学意义（P〉0．05），但低于空质粒pEGFP—C2组（19．45％±2．05％），且差异有统计学意义（P〈0．05）。结论HSV-2LATORF3在Vero细胞中具有抗顺铂诱导的凋亡作用。

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体ORF2的表达及其抗凋亡作用

本文探讨了单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)的开放读码框2(ORF2)在细胞中的表达,及其对5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的非洲绿猴肾细胞(Vero)凋亡的影响。通过将重组质粒pEGPF-ORF2转染Vero细胞,绿色荧光蛋白检测转染效率,RT-PCR验证目的基因的表达,5-FU诱导细胞凋亡,通过荧光显微镜观察凋亡小体,Gimesa染色检测细胞核形态,MTT法检测细胞的存活率,DNA ladder片段分析,结果表明,转染后绿色荧光蛋白表达效率很高,RT-PCR验证有目的基因的转录。凋亡诱导后的细胞形态正常,MTT法分析活性率与正常无差异,而显著高于空质粒组,DNA ladder未见凋亡条带。由此我们认为HSV-2LAT ORF2基因在Vero细胞中得到了高效表达,并且具有抗5-FU诱导的凋亡作用。

稳定表达绿色荧光蛋白标记的人单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体ORF2融合蛋白的Vero细胞株的建立

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框2(ORF2)融合蛋白的Vero细胞株。方法构建重组真核表达质粒pEGFP-ORF2,经酶切及测序鉴定正确后,体外转染Vero细胞,经G418筛选稳定表达融合蛋白的克隆,扩大培养后,荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR检测目的基因的转录。结果重组真核表达质粒pEGFP-ORF2经酶切及测序鉴定构建正确,经G418培养20d筛选出的Vero细胞株荧光显微镜下可见融合蛋白表达,RT-PCR检测显示,转染了重组表达质粒的Vero细胞内有目的基因的表达。结论已成功建立了稳定表达EGFP-ORF2的Vero细胞株,为进一步研究HSV-2LATORF2的功能奠定了基础。

单纯疱疹病毒的生物学特点及其潜伏复发机制研究进展

目的:单纯疱疹病毒属疱疹病毒a亚科,是双链DNA病毒,可分为HSV-1及HSV-2两种血清型,感染后可在体内长期潜伏,易复发,给相关疾病的治疗及预防造成了巨大困难。阐明病毒潜伏感染及复发的相关机制,对进一步揭示HSV感染复发发生的本质,以有效防治HSV感染及潜伏复发有重要意义。本文综述了单纯疱疹病毒的生物学特点及其潜伏复发机制研究进展。

单纯疱疹病毒潜伏感染的分子基础

单纯疱疹病毒在体内的生存策略是建立潜伏感染,一定条件下被激活而致病情复发。虽然近年来在分子水平对潜伏感染和再激活进行了相当的研究,但确切机制尚不十分清楚。目前受到关注的主要有潜伏相关转录体、立即早期基因、病毒蛋白16、组蛋白修饰以及CD8+T细胞。进一步研究有助于寻找和发现针对性预防和治疗HSV感染的新方法或药物。

单纯疱疹病毒的潜伏、复发感染与防治

单纯疱疹病毒(HSV)分为HSV-1及HSV-2两种血清型,感染后可在人体内长期潜伏且易复发,造成治疗及预防上的巨大困难。潜伏相关转录体(LATs)是单纯疱疹病毒潜伏期间大量存在和被转录的RNA,也是目前研究单纯疱疹病毒潜伏与复发机制的热点。近年来的研究使研究者们对LATs在单纯疱疹病毒潜伏、复发中所起的作用有了更进一步的认识。CTCF(CCCTC binding factor)是广泛存在于真核生物的多功能转录因子,其M段11个锌指结构可以形成不同的组合,调控多种靶基因的表达。CTCF在病毒的潜伏和激活过程中发挥着重要的调节作用,CTCF从结合位点脱落,病毒将被激活进行复制。目前,HSV感染的治疗主要依靠口服抗病毒药物,但难以清除患者体内潜伏的病毒,因此研究HSV疫苗已成为预防和治疗生殖器疱疹的关键。虽然目前尚无安全有效的疫苗批准上市,但其研制已取得一定的进展。阐明病毒潜伏及感染复发的具体机制,对揭示HSV感染易复发的本质,及有效防治HSV感染有重要意义。

单纯疱疹病毒性角膜炎中HSV-1潜伏感染的研究进展

由单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus，HSV－1）感染所致的病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis，HSK）是一种严重的致自性眼病，HSK难以治愈的主要原因是HSV－1可以潜伏在宿主体内并反复发作，因此加强这方面的研究对HSK的临床治疗具有重要意义。本文闸述了HSV－1在宿主体内潜伏感染的神经元潜伏和非神经元潜伏两种类型，HSV－1潜伏感染过程中的关键因子潜伏相关转录体（latency associated transcript，LAT）在建立、维持HSV－1的潜伏感染与HSK复发中的功能，以及潜伏感染过程中的其他相关因素。

双秦眼用凝胶对小鼠单疱病毒性角膜炎的抗复发作用研究

目的:探讨双秦眼用凝胶对小鼠单疱病毒性角膜炎(HSK)的抗复发作用。方法:用角膜病毒接种法给BALB/c小鼠接种单纯疱疹病毒I型(HSV-1)SM44株,随机分为对照组、无环鸟苷(ACV)组、双秦眼用凝胶组。连续给药2周,停止用药8周后紫外线B(UV-B)光照射,诱导HSK复发,观察各组小鼠泪液膜擦拭液的病毒检出率、UV-B光照射前后病变部位体征评分、角膜组织结构、聚合酶链反应(PCR)方法检测三叉神经节(TG)内HSV-1的潜伏,以及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测TG内潜伏相关转录子(LAT)的表达情况。结果:UV-B光照射后,各组检出率均呈不同程度的升高;在照射后7d的泪液膜擦拭液里,除第3-5天双秦眼用凝胶组的泪液膜擦拭液里的病毒检出率高于ACV组外,其余几天,双秦眼用凝胶组的病毒检出率均低于其余两组。但是,比较各组间每天的病毒检出率,均无显著统计学差异;在病变部位体征评分方面,应用双秦眼用凝胶治疗后的小鼠在UV-B光照射诱导后病变程度轻于其余两组(P<0.05);HE染色观察角膜组织结构发现,UV-B光照射后,对照组及ACV组角膜均有不同程度的损伤,双秦眼用凝胶组角膜各层结构大致正常;双秦眼用凝胶组TG内HSV-1的潜伏及LAT的表达均受到抑制;用PCR技术检测各组小鼠TG内HSV-1 DNA的灰度值,结果显示,双秦眼用凝胶优于对照组(P<0.05)及ACV组(P<0.01);应用RT-PCR技术检测并比较各组小鼠TG内LAT m RNA的灰度值,双秦眼用凝胶亦优于对照组(P<0.01)及ACV组(P<0.05)。结论:双秦眼用凝胶在一定程度上可以降低HSK小鼠泪液膜擦拭液的病毒检出率,减轻UV-B光照射后角膜病变体征、保护角膜的组织结构、抑制TG内HSV-1的潜伏和LAT的表达,但双秦眼用凝胶对小鼠HSK的抗复发作用及机制仍需在增加样本量、排除外界因素影响的基础上进一步研究探讨。

双秦眼用凝胶对小鼠单疱病毒性角膜炎的干预作用及三叉神经节内LAT表达的影响

目的:探讨双秦眼用凝胶对小鼠单疱病毒性角膜炎(HSK)的干预作用及三叉神经节(TG)内潜伏相关转录体(LAT)表达的影响。方法:用角膜病毒接种法给BALB/c小鼠接种Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)SM44株,随机分为对照组,无环鸟苷(ACV)组,双秦眼用凝胶组。连续给药2周,通过对病变部位体征评分、角膜组织病理观察以及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测LAT在TG内的表达情况综合评价双秦眼用凝胶对HSK模型小鼠的药效及作用机制。结果:治疗14d后,双秦眼用凝胶组和ACV组的病变程度较对照组减轻,差异有统计学意义(P<0.01),同时双秦眼用凝胶组优于ACV组,差异有统计学意义(P<0.05)。角膜组织病理学观察发现,双秦眼用凝胶组角膜各层结构大致正常,其余各组均出现病理损伤。RT-PCR检测各组小鼠TG内LAT mRNA半定量RT-PCR灰度值,结果显示,双秦眼用凝胶对TG内LAT表达的抑制作用优于对照组(P<0.05),而ACV抑制LAT表达的作用不明显。结论:双秦眼用凝胶不仅可以减轻HSK的病变程度、保护角膜正常的组织结构,而且可以抑制LAT在TG内的表达。