G-四链体在糖酵解相关基因中的分布及调控

目的探讨G-四链体(G4)在糖酵解相关基因中的分布及调控。方法选取200个糖酵解相关基因转录起始位点上游1500 bp至5′非翻译区的序列进行生物信息学分析,初步确定含有潜在G-四链体形成序列(PQS)的相关基因;圆二色谱法和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测G4形成;外切酶Ⅰ(ExoⅠ)水解实验在0,0.5,2,8,16和32 min检测G4稳定性;构建将相关基因的特定片段插入到荧光素酶表达序列之前的报告基因质粒,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达水平进而判断G4对启动子活性的影响;实时荧光定量PCR检测荧光素酶的mRNA水平进一步验证G4的转录调控作用。结果①生物信息学分析表明,200个糖酵解相关基因中有12个基因含有PQS,进一步结合PQS长度及结构分析,醛缩酶A(ALDOA)和磷酸变位酶2(PGAM2)的PQS理论上可形成稳定G4。②ALDOA和PGAM2均在260 nm处有最大正吸收峰,在240 nm处有最大负吸收峰,符合平行结构G4的特征构象,同时二者的PQS可形成G4。③ExoⅠ消化后,ALDOA和PGAM2无明显水解,证明G4具有稳定性,同时二者的PQS突变后均可逐渐被水解。④ALDOA突变后荧光素酶的表达水平和mRNA水平显著升高(P<0.01);PGAM2突变后荧光素酶的表达水平和mRNA水平显著降低(P<0.01)。结论糖酵解相关基因的序列中存在大量PQS,其中ALDOA和PGAM2的PQS可形成稳定G4,并具有转录调控作用。

22-nt端粒RNA片段所形成反向平行G-四链体的构型影响要素分析

不同构象的G-四链体通常展现出与蛋白质结合能力不同,进而发挥出不同的生理功能,分析G-四链体的构型影响要素,对探究其生理功能有重要意义。不同于DNA,RNA序列在以往的研究中均呈现平行G-四链体结构,前期研究中我们发现并报道了目前唯一能形成反向平行G-四链体的RNA序列,22-nt端粒RNA片段(ORN-N,A_(1)G_(2)G_(3)G_(4)U_(5)U_(6)A_(7)G_(8)G_(9)G_(10)U_(11)U_(12)A_(13)G_(14)G_(15)G_(16)U_(17)U_(18)A_(19)G_(20)G_(21)G_(22))。分析ORN-N的构型影响因素将极大拓展对RNA特性的认识。因此,本研究旨在系统性的探索能够影响ORN-N构型的因素。使用圆二色谱和熔融曲线监测糖环2′-羟基对ORN-N构型和稳定性的影响,发现ORN-N中不同核苷糖环2′-羟基对于反向平行G-四链体的作用不同。U_(6)、A_(7)、G_(16)的糖环2′-羟基对ORN-N的拓扑构象-维持至关重要,G_(3)、A_(13)、A_(19)的糖环2′-羟基具有稳定其构象的作用,而U_(17)的糖环2′-羟基降低了ORN-N的稳定性,此与以往研究中糖环2′-羟基不利于RNA序列形成反向平行G-四链体构型不同。将ORN-N环中的核苷U进行5-甲基化修饰,通过圆二色谱和熔融曲线监测其构象和稳定性,发现环中部分U碱基5-甲基化能稳定ORN-N的构象。使用5%~40%PEG模拟细胞内分子拥挤环境,通过圆二色谱监测其构象,结果与以往研究不同,分子拥挤环境并不能稳定反向平行RNA G-四链体,相反ORN-N的构象发生了翻转。综上,在ORN-N中糖环2′-羟基、环序列甲基化以及分子拥挤环境对反向平行RNA G-四链体的构型具有极其重要的影响。

CSTB基因启动子区十二核苷酸重复序列d[CGCGGGGCGGGG]n形成串联G-四链体的研究

DNA串联重复序列扩展是引起多种神经性疾病的一个重要因素。对重复序列形成的高级结构研究可为相关疾病的发病机制和治疗策略提供重要的理论基础。位于半胱氨酸蛋白酶抑制剂B(cystatin B,CSTB)基因启动子区的一段十二核苷酸重复序列d[CGCGGGGCGGGG]n的扩展是导致其表达异常,进而引起神经退行性疾病进行性肌阵挛癫痫(progressive myoclonus epilepsy,EPM1)的主要原因。但对其可能机制及高级结构的研究尚未见报道。本研究采用圆二色光谱法(circular dichroism spectroscopy,CD)和核磁共振波谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR),对含有多个重复单元的d[CGCGGGGCGGGG]n(n=2,4)形成的高级结构进行了解析。结果发现,含有2个重复单元的d[CGCGGGGCGGGG]2序列,可在1价阳离子K+诱导下,形成稳定的平行链G-四链体结构。而含4个重复单元的d[CGCGGGGCGGGG]4序列,可在分子内形成串联G-四链体堆叠排列。说明含多个重复单元的十二核苷酸重复序列,可形成分子内串联堆叠G-四链体高级结构。这些结果为十二核苷酸重复序列扩展,导致CSTB基因表达异常的分子机制提供了一种可能的合理假说,并为后续寻找小分子配体识别十二核苷酸串联重复扩展序列,进而调控CSTB基因表达的EPM1治疗策略提供了理论基础。

G-四链体序列的微小变化对结构及钾离子传感的影响

人体端粒DNA重复单元GGGTTA在K^＋溶液中可以形成G-四链体结构,并已成功利用结构变化过程中的荧光改变进行K＋的检测。在此基础上研究了在寡聚核苷酸的GGG部分插入腺嘌呤碱基A对G-四链体结构及在K＋检测中的影响。借助圆二色光谱、质谱和荧光光谱的方法可以分别获得序列变化引起的G1四链体排列的平行或反平行结构,可以结合的K＋数目,以及在K^＋传感时所适用的K＋浓度范围。在GGG中插入A可以使K^＋更容易进入G-四链体分子空穴,但当在两个GGG中同时插入A时,G-四链体结构难以形成。基于K＋线性响应范围的变化（由0.02-1 mmol/L变为0.2-16 mmol/L）,可以改进基于DNA的K＋传感器,使直接测定人体血清中K＋的含量成为可能。

基因组G-四链体与疾病的关系

G-四链体(G-quadruplex, G4)是一种特殊的核酸二级结构,形成于单链DNA或者RNA的富含鸟嘌呤的区域。其广泛存在于基因组中,多位于端粒、启动子和UTR等区域。G4结构检测的生物物理学方法可以获取G4具体的空间结构信息,而生物学检测方法通常与高通量测序技术结合,可以对G4做全基因组范围内的测序分析。G4结构在生物体内有着非常重要的调控功能,它可以影响染色质结构、基因调控以及基因组稳定性,因此与人类疾病密切相关,包括癌症、神经系统疾病、贫血症等。G4可以作为药物的靶标,迄今已有许多G4特异的配体被研发出来,在疾病治疗方面无疑具有很好的应用前景。