猪流行性腹泻病毒和猪Delta冠状病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为快速、便捷地检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)混合感染病原,试验根据Genbank收录的2种病毒的M基因序列,分别设计2对引物,通过对RT-PCR反应优化,最终建立了PEDV和PDCoV二重RT-PCR扩增检测方法,验证其特异性和敏感性,将该方法应用于临床病料的检测。结果显示,利用建立的二重RT-PCR方法对PEDV和PDCoV进行扩增,分别获得750 bp和372 bp的特异性目的条带,最佳退火温度为56℃。扩增未见CSFV、PRV、PPV病毒基因片段,而能够同时扩增出PEDV和PDCoV目的基因片段。PEDV/PDCoV 2种病毒混合核酸最小检测量为0.1 ng。对临床疑似病料检测结果符合率为100%。表明建立的PEDV/PDCoV二重RT-PCR方法具有较好的特异性、灵敏性和临床适用性,为PEDV、PDCoV的快速、准确临床诊断和有效防控提供了检测技术手段。

猪Delta冠状病毒的流行病学调查及M基因序列分析

为了解猪Delta冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)在发生腹泻疫情猪群中的感染情况,根据PDCoV M基因的保守序列设计了一对RT-PCR检测引物,建立了猪Delta冠状病毒的RT-PCR的检测方法,其最低核酸检测限量为3.92×10^3 copies/μL,特异性和灵敏度均较好。利用该方法对2015—2017年上海周边猪场的518份猪腹泻粪便样品进行检测,检测出25份PDCoV阳性样品,感染阳性率达4.8%。在所检出的阳性样本中,PDCoV与猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)和猪星状病毒(porcine astrovirus,PAstV)的混合感染率较高,分别为40%和48%;PDCoV与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)混合感染率为8.0%,未检测到PDCoV与猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TEGV)混合感染的样本。随机选取10份PDCoV阳性样本,对扩增的M基因片段同源性进行分析,结果,10份样品中核苷酸同源性达95.0%—99.6%,与GenBank登录的PDCoV毒株的同源性为96.1%—100%,说明目前流行的PDCoV毒株的遗传差异不大,该研究为了解PDCoV流行情况提供了参考依据。

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对Gen Bank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳(N)蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒(PKoV)、猪星状病毒(PAstV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012—2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】1以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI Gen Bank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;2将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCo V序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;3本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;4所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×106拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×101拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×103拷贝/μL;5应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012—2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%(78/249),母猪粪便中PDCoV的检出率(27.78%)稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率(31.92%),最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012—2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立

猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)已经成为养猪行业的主要疫病。建立能够同时检测且能区分这2种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PEDV和PDCoV基因序列,分别用PDCoV M基因和PEDV M基因设计了2对引物,并对PEDV的M基因片段和PDCoV的M基因片段进行扩增,通过对PCR反应条件的优化,建立了检测PDCoV和PEDV双重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。特异性和敏感度的试验表明,此方法对PDCoV和PEDV核酸的最低检测量分别为3.27×10~3拷贝/μL和3.63×10~4拷贝/μL,具有较高的敏感度;该方法可同时扩增出340 bp(PDCoV)和520 bp(PEDV),但不能扩增出猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪博卡病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。多重PCR与单一PCR符合率100%。表明此方法可以用于PDCoV和PEDV的检测。

猪Delta冠状病毒及其检测技术研究进展

猪Delta冠状病毒是近年来新发现的导致仔猪腹泻、呕吐和脱水的肠道致病性冠状病毒,仔猪感染后有较高的发病率和病死率。本文简要概述PDCoV病原学、流行病学及其检测方法研究现状,以期未来对PDCoV感染的流行病学调查和疫情防控提供参考。

新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV）是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒，感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状，和猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）临床症状极其类似，且I临床上混合感染病例较多，单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病，因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoVM基因和PEDVORF3基因特异性序列设计引物，扩增相应的基因片段，克隆构建重组质粒pMD-18T—PDCovM与pMD-18T—PEDVORF8，测序验证后，分别以此重组质粒为标准品，建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBRGreenI双重荧光RTPCR方法，并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化，同时对所建立的双重荧光RT—PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示，该试验成功建立了能同时检测PDCov和PEDv的SYBRGreenI双重荧光RTPCR方法，最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28．6拷贝/μL和99．6拷贝/μL的质粒浓度，显示出较好的敏感性；在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性；特异性试验表明，该方法仅能检测出PEDV和PDCoV，而对猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪伪狂犬病毒（PRV）等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RTPCR方法以及单重荧光定量RT—PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PD—CoV检测，结果显示，PDCoV阳性样品41份，阳性率为20．7％；PEDV阳性样品59份，阳性率为29．8％；同时感染这2种病毒的样品17份，阳性率为8．6％。与单重荧光定量RT—PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样，符合率100．0％。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT—PCR方法，能同时准确地检测PDCoV和PEDV，这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用

自2014年美国首次报道猪Delta冠状病毒(PDCoV)以来,该病毒相继在我国一些猪场检测到,由于其发病症状和病理剖检与猪流行性腹泻(PED)极其相似,且易出现混合感染,临床很难区分,给养殖业造成严重经济损失,因此建立能够同时检测且能区分这两种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PDCoV和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列,设计了2对分别用于扩增PDCoV N基因和PEDV M基因的目的片段的引物,通过对RT-PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PDCoV和PEDV的双重RT-PCR检测方法,并对该方法进行了灵敏性、特异性和重复性研究。结果显示,该双重RT-PCR对PD-CoV和PEDV的最低检测量分别是3.14×10~3 copies/μL和3.88×10~4 copies/μL。该方法仅对PDCoV和PEDV检测为阳性,对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、博卡病毒(PBoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病毒(PRV)等猪常见的感染病毒的扩增均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。用建立的双重RT-PCR方法对111份临床样品进行检测,其中PDCoV阳性样品22份,阳性率为19.82%,PEDV阳性样品27份,阳性率为24.32%,PDCoV和PEDV共感染的样品数为10份,阳性率为9.01%。本试验所建立的双重RT-PCR方法能够快速、准确地对PDCoV和PEDV单一或混合感染的临床样品进行快速检测,为临床上对PDCoV和PEDV鉴别诊断和流行病学调查研究提供了新的技术手段。

猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)基因序列,分别设计特异性引物,扩增PEDV N基因(750 bp)、TGEV M基因(544 bp)、PDCoV N基因(183 bp)和PRoV VP6基因(329 bp)。经过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化及特异性、敏感性、重复性试验,成功建立了快速鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法仅对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测为阳性,对口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)等主要病毒的扩增均为阴性。PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV重组质粒标准品的检出下限分别为1.57×10~2、1.57×10~3、1.57×10~2、1.57×10~2copies/L。相同条件下的重复性试验获得均匀一致的结果。应用所建立的方法检测2017—2018年采集自广西各地的270份腹泻病料,结果显示,PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56%、11.48%、10.74%、1.85%,并且存在混合感染现象。上述结果表明,所建立的多重RT-PCR方法可用于PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的快速鉴别检测及流行病学调查。

猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒（PDcoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）均是能引起仔猪腹泻的冠状病毒，通过临床症状和剖检很难鉴别诊断，建立同时检测且能够鉴别诊断这3种疾病的快速检测方法对于临床诊断具有重要的意义。参照GenBank中登录的PDCoV，NPEDVM和TGEVN基因的基因序列，利用Primer5．0设计合成3对能扩增特异性目的片段的引物，构建重组质粒，并对RT-PCR反应条件进行优化，建立了检测PDCoV，PEDV和TGEV的多重RT—PCR诊断方法，并对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性分析。利用该方法对河南176份临床样品进行检测，并与普通RT-PCR检测方法对该检测方法进行比较分析。结果表明，所建立的三重RT-PCR方法对PDCoV的最低检测量是3．14×10 3拷贝／uL；PEDV的最低检测量是3．88×10 4拷贝／uL和TGEV的最低检测量是3．68×10 4拷贝／uL。所建立的方法具有较好的特异性，对猪博卡病毒（PboV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟（CSFV）和猪圆环病毒（PCV）等猪常见病毒的扩增结果均为阴性。应用所建立的三重RT-PCR方法对176份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV，PDCoV和TGEV检测，并将检测结果和单重RT-PCR检测方法比较，结果显示，多重RT—PCR检测结果与常规单一RT～PCR的结果符合率均为100％。综上，本试验建立了能同时检测PDCoV，PEDV和TGEV的三重RT—PCR方法，为临床上这3种疫病的快速检测和流行病学调查奠定了基础。

四重荧光qRT-PCR检测猪腹泻相关病毒方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪delta冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV)和猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)的四重荧光qRT-PCR检测方法,本研究以PEDV的N基因、TGEV的S基因、PDCoV的M基因和PTV基因组5'非编码基因为检测对象,建立同时检测4种病毒的荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法可以特异扩增4种病毒的基因,不能扩增猪呼吸道冠状病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的基因;PEDV、TGEV、PDCoV和PTV的最低核酸检出量分别为141、68、8和11拷贝数;对100份送检样品进行检测,其中PEDV、TGEV、PDCoV和PTV感染检出率分别为10%、6%、2%和55%。结果表明本研究建立的检测方法具有良好的特异性和敏感性,而且操作快速简便,可用于猪腹泻疫病的临床诊断和流行病学调查。

猪Delta冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒多重PCR检测方法的建立和应用

旨在建立快速准确检测与猪腹泻相关的猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)多重PCR检测方法。针对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计了4对特异性引物,分别扩增PDCoV N基因(447 bp)、PEDV M基因(204 bp)、TGEV M基因(612 bp)、PRoV VP6基因(329 bp),经过对反应条件的优化,成功建立了能同时特异性检测PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR,且特异性好。应用该检测方法对上海及周边地区养殖场临床猪腹泻病料进行检测,结果检出PEDV阳性样品16份,其中PEDV和TGEV混合感染1份,PDCoV和PRoV均未检出,与单一RT-PCR检测结果完全吻合。该快速检测方法的成功建立,将有助于提高对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的病原学调查和疾病监测,为生态养殖提供技术储备。

猪Delta冠状病毒的研究进展

Delta冠状病毒是冠状病毒科冠状病毒亚科的新成员，可感染禽类和哺乳动物。目前冠状病毒主要分为4个群，包括Alpha冠状病毒、Beta冠状病毒、Gamma冠状病毒和Delta冠状病毒。

凉山地区猪腹泻样本中PEDV、PDCoV和GARV感染检测

为了解四川省凉山州部分猪场3种猪腹泻病毒的感染情况,本研究采用RT-PCR方法,分别对来自德昌、冕宁县和宁南县多个规模化猪场的60份猪腹泻样本进行病原检测,包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪A群轮状病毒(GARV)。结果显示:3种病原的检出率分别为PEDV15%、PDCoV33.33%、GARV58.33%,其中冕宁县PDCoV检出率为65%,而GARV检出率更高达70%;3种病毒混合感染的情况普遍存在,总体混合感染率分别为:德昌15%(3/20),冕宁60%(12/20),宁南5%(1/20),混合感染类型中尤以PDCoV和GARV的混合感染率最高,提示PDCoV和GARV可能存在更高的协同致病性。

2011—2017年浙江省猪病毒性腹泻病的流行病学调查

为了解浙江省不同地区猪群中猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（Po RV）和猪Delta冠状病毒（PDCo V）导致猪病毒性腹泻的感染情况,本研究应用RT-PCR方法对2011—2017年收集的浙江省不同地区猪腹泻样品进行4种病毒的检测与分析。结果显示,2011年至今,PEDV阳性率为71.25%,TGEV阳性率为3.05%,Po RV阳性率为17.67%,PDCo V阳性率为8.75%;单独感染中PEDV阳性率为51.89%,TGEV阳性率为0.94%,Po RV阳性率为5.19%,PDCo V阳性率为4.25%;混合感染中PEDV/TGEV阳性率为2.4%,PEDV/Po RV阳性率为15.1%,PEDV/PDCo V阳性率为2.8%,Po RV/PDCo V阳性率为0.5%,PEDV/TGEV/PDCo V阳性率为0.5%。结果表明,浙江省不同地区存在这4种病毒所导致的猪病毒性腹泻病,其中在单独感染中以PEDV感染为主,混合感染中以PEDV/Po RV二重混合感染为主。不同年份中以PEDV感染最为严重,阳性率均在50%以上;Po RV感染在2015年上半年阳性率高达60.9%,其余年份均稳定在20%左右;TGEV每年均有零星发病;PDCo V在2016年感染最为严重,阳性率为22.9%。该结果为浙江省猪病毒性腹泻病的诊断和防控积累了资料。

重组酶聚合酶扩增技术快速检测猪肉及其制品中ASFV、PDCoV和SVA

目的建立非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和A型塞内卡病毒(SVA)多重重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法。方法以重组质粒为模板进行RPA检测,并优化温度、时间、引物探针配比等反应条件,建立多重RPA检测方法,应用于实际样本的检测;与实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)结果对比,评价所建立方法的准确率。结果本方法可在20 min内实现对3种病毒的同时检测,特异性良好;对ASFV、PDCoV、SVA灵敏度分别为940、770、570 copies/μL;用于实际核酸样本检测,准确率分别为93.33%、100.00%、100.00%。结论本文建立的多重RPA方法快速、便捷,适合猪肉及其制品中ASFV、PDCoV、SVA的现场初筛。

3种猪腹泻相关病原核酸液相芯片检测方法的建立

为建立同步检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)3种腹泻相关病原体的快速高通量检测方法,本研究利用Lumeinex技术原理,建立三重液相芯片方法。结果显示,该方法可准确检出TGEV、PEDV和PDCoV 3种猪腹泻病原,与猪轮状病毒、口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、非洲猪瘟病毒等常见猪病病原无交叉反应;三重液相芯片方法对TGEV、PEDV和PDCoV核酸的检测灵敏度分别为33.2 pg/μL、163 pg/μL和12.1 pg/μL。应用该方法与荧光RT-PCR方法对52份临床样品同时检测,结果符合率为100%。研究结果表明,所建立的三重液相芯片方法可准确检测TGEV、PEDV和PDCoV,具有良好的特异性和敏感性。

同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCo V)的多重RT-PCR方法,根据Gen Bank中PEDV和TGEV基因序列保守区设计2对引物,参照文献合成1对PDCo V引物,优化三对引物在同一RT-PCR扩增体系下的浓度、退火温度等反应条件,同时优化方法的灵敏度、特异性。将初步建立的多重RT-PCR方法用于检测采自四川省及重庆市14个猪场的222份样品。结果表明,本试验建立的多重RT-PCR在引物量分别为PEDV 0.2 L,PDCo V 0.2 L和TGEV 0.4L,退火温度为53℃时的扩增效果最佳;最低检测量分别为PEDV:60.96 pg、PDCo V:58.85 pg、TGEV:102.69 pg;用该法对多种猪传染病病原DNA或c DNA进行扩增时均无非特异性扩增条带出现。对222份腹泻样品的检测结果表明,PEDV阳性检出率为52.2%,PDCo V为2.7%,TGEV为2.3%。同时多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR检测方法符合率分别为PEDV 92.9%、PDCo V 100%、TGEV 100%。表明该法具较高可信度。本试验建立了一种高效、特异地同时检测PEDV、TGEV和PDCo V的多重RT-PCR方法,为病原的实验室诊断和分子流行病学调查提供了技术支持。对四川省及重庆市部分猪场三种病原流行情况进行调查和统计分析,为地区猪腹泻病的防控提供了依据。