应用激光扫描共聚焦显微成像术研究光敏剂亚细胞定位

目的应用激光扫描共聚焦显微成像系统及荧光定量分析方法,探讨血卟啉单甲醚(HMME)在靶细胞亚细胞结构中的精确定位及定量分析的可行性。方法将传代培养的鼠肺内皮细胞与HMME共同孵育24h。应用激光扫描共聚焦显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针若丹明(rhodamine)-123、荧光素黄(luciferyellow)、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体。采取不同的采集顺序激发染色细胞样品,通过预先设置的相应的发射滤光片分别采集细胞内HMME与细胞器探针的荧光图像。通过计算机图像处理,采用像素-荧光强度分析方法对光敏剂进行亚细胞定位。结果采用先激发探针后激发HMME的顺序,HMME及荧光探针的荧光强度及形态特征保持较好;细胞质与细胞核内HMME平均荧光光强差异有显著意义,前者是后者的2倍以上;HMME在4种细胞器区域平均荧光光强与细胞平均荧光光强(J1/J2)比值的差异有显著意义;随参数m的增高,HMME在4种细胞器区域J1/J2比值呈下降趋势。结论HMME在细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体均有分布;应用激光共聚焦显微成像系统结合荧光定量分析法能对荧光效率极低的光敏剂进行精确的亚细胞定位及分布定量比较。

利用激光扫描共聚焦显微术对同源四倍体水稻胚囊形成与发育的进一步观察

应用改进的整体染色透明激光扫描共聚焦显微术(WCLSM),对同源四倍体水稻PDER-2B-4x胚囊的形成与发育过程进行观察。发现其胚囊的形成发育过程与二倍体的一致,可以清楚地划分为8个发育时期,即孢原细胞形成期、大孢子母细胞形成期、大孢子母细胞减数分裂期、功能大孢子形成期、单核胚囊形成期、胚囊有丝分裂期、八核胚囊发育期和成熟胚囊期。除正常发育的过程外,大孢子发育的各个过程均出现一些异常现象,包括:细胞退化、核位置异常、核数目异常和细胞分化异常等。这些异常可能最终导致多种结构异常成熟胚囊的形成。

双光子及共聚焦激光扫描显微术研究天花粉蛋白对人绒癌细胞的作用机制

天花粉蛋白 (trichosanthin ,TCS)是从中草药栝楼根中提取的一种核糖体失活蛋白 ,具有抗肿瘤和抗HIV功能 .应用双光子及共聚焦激光扫描显微术结合特异性荧光探针Hoechst 3334 2、 2′,7′ 二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH DA)、Indo 1和Fluo 3 AM ,首次同时观察了TCS诱导人绒癌细胞 (JAR细胞 )凋亡过程中活性氧自由基 (ROS)和细胞内钙离子浓度 ([Ca2 + ]i)的变化 ,实验结果表明TCS引起的 [Ca2 + ]i 升高和ROS形成参与了TCS诱导的JAR细胞凋亡 ,并且ROS形成和 [Ca2 + ]i 升高有关 .共聚焦激光扫描显微术的研究结果表明 ,[Ca2 + ]i 升高不是导致ROS形成的主要原因 。

共聚焦激光扫描显微术研究天花粉蛋白对小鼠胚胎细胞的作用机制

天花粉蛋白是从中草药禾古楼根中提取的一种核糖体失活蛋白 ,具有致流产、抗肿瘤和抗 HIV功能。本文应用共聚焦激光扫描显微术结合特异性荧光探针 2′,7′-二氯荧光黄双乙酸酯和 Fluo3- AM,观察了天花粉蛋白作用于小鼠胚胎细胞过程中活性氧自由基和细胞内钙离子浓度的变化。实验结果表明 ,天花粉蛋白能诱导小鼠胚胎细胞钙浓度升高和产生活性氧自由基 ,并且天花粉蛋白能有效抑制小鼠胚胎细胞的分裂 。

利用激光扫描共聚焦显微镜研究植物细胞发育形态学变化

通过激光扫描共聚焦显微镜,利用不同种类(波长)的激光研究植物细胞发育形态学变化。结果表明,利用紫外激光(351 nm)扫描可以清楚地观察到拟南芥叶片表皮细胞的形态及其变化,在已分化的叶片表皮上可观察到包括“铺垫”表皮细胞(epidermal pavement cells)、气孔保卫细胞(guard cell)、气孔伴胞(subsidiarycells)、表皮毛细胞(trichomes)和表皮毛的足细胞(socket cells)等多种形态不同的细胞种类;利用蓝光激光(488nm)辅助曙红浅染,可清晰地显示出拟南芥根生长区内部的各种原始细胞,包括静止区(quiescent center)细胞、皮层/内皮层原始细胞(cortex/endodermal initial cell)、表皮/根冠原始细胞(epidermal/root cap initial cell)和中柱/根冠原始细胞(columella/root cap initial cell)等。利用双光子激光(800 nm)连续扫描30 s可以诱发叶绿体产生自发荧光,并可观察到叶绿体在叶肉细胞中的运动轨迹。结果说明激光扫描共聚焦显微镜在植物细胞形态及发育研究上具有独特的功能。

激光扫描共聚焦显微镜显示土壤原生动物细胞结构的研究

介绍了一种运用激光扫描共聚焦显微术显示土壤原生动物细胞结构的方法,试验结果较清晰地显示出该纤毛虫细胞表面纤毛器及纤毛器基部附属微管结构,并总结了试验操作过程中的注意点。

激光扫描共聚焦显微技术在农业科研领域中的应用

激光扫描共聚焦显微技术(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)是当今世界上最先进的分子细胞生物学分析技术。LSCM能够进行三维重建、静态结构分析、活体细胞或组织功能的实时动态检测等,且能够获得较普通显微镜更高的空间分辨率。LSCM作为一项全新的实验手段和强有力的研究技术,近年来已在诸多领域显示出其强大的优势和生命力,将细胞水平研究的深度和广度大幅拓展。本文首次阐述了LSCM在农业科研领域中的应用,介绍其在作物育种、生长发育调控、植物保护、生物制药、食品加工和畜牧兽医等方面的应用。

应用激光扫描共聚焦显微术观察血小板活化及其形态改变

目的建立应用激光扫描共聚焦显微术(laser scanning confocal microscopy,LSCM)观察血小板活化及其形态改变的方法。方法用不同浓度的胶原诱导血小板活化,通过LSCM观察与特异性荧光(FITC/PE)抗体结合的血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)荧光强度的变化,判断血小板微颗粒(platelet microparticle,PMP)的产生,同时观察正常人和糖尿病视网膜病变患者血小板形态的差异。结果加入诱导剂后血小板活化,镜下观察特异性抗体标记的血小板荧光强度呈规律性变化。在一定浓度时诱导剂胶原的加入可引起血小板GPⅡb/Ⅲa表达量的变化,且随着胶原浓度的增加,GPⅡb/Ⅲa表达量也有增加的趋势。并观察到糖尿病视网膜病变患者血小板有伪足伸出,末端附近有释放的微颗粒环绕,与正常人血小板形态有明显差异。结论应用LSCM可观察到诱导剂致血小板活化引起GPⅡb/Ⅲa表达量的变化以及血小板微颗粒的释放,同时可认为血小板形态改变的观察在血栓病血小板活化程度的判断上具有一定的价值。

激光扫描共聚焦显微术在生物医学中的研究

激光扫描共聚焦显微技术的发展 ,为形态学、分子细胞生物学、神经科学、肿瘤医学、药理学、遗传学等领域的研究提供了新的先进研究方法和手段。本文对激光扫描共聚焦显微术在粘附细胞分选 ,动态荧光分析测定 ,显微细胞外科和光陷阱技术 。

激光扫描共聚焦显微镜观察冻存对SHR卵母细胞的影响

目的 冻存未受精的成熟卵母细胞（MII期）比冻存同一品系的处于卵裂期的胚胎更困难。因为卵母细胞的某些内部结构对低温很敏感。本研究的目的是希望能够更有效地观察冻存对卵母细胞的影响。方法 我们运用激光扫描共聚焦显微术（CLSM）的光学切片和三维图像重建技术，研究冻存对自发性高血压大鼠（SHR）卵母细胞的结构，尤其是对纺锤体、染色体的影响，以及冻存对体外受精的影响。结果 我们不仅观察到有的卵母细胞冻存后仍维持着完整的桶状纺锤体以及紧密排列的染色体，而且能观察到卵母细胞内均匀分布着细胞质微管星体。冻存也造成对一些卵母细胞纺锤体和细胞质微管星体的破坏。结论 CLSM能够清晰有效地观察冻存对未受精卵纺锤体、染色体以及胞质微管星体的影响，我们推想冻存后卵母细胞的体外受精率下降与这些结构的受损有关。

二次离子质谱-激光扫描共聚焦显微镜联用对单细胞显微成像-原理及应用

二次离子质谱(SIMS)分析主要用于半导体、地质等领域材料表面分析,随着科学仪器技术的发展,近年来,SIMS在生命科学领域中得到了越来越广泛的应用。SIMS可以实现对样品表面的质谱分析、化学成像以及深度剖析。三维SIMS成像分析的横向分辨率可达80~100 nm,纵向分辨率1~5 nm。但是,由于缺少特异性指示亚细胞结构的碎片离子,单细胞SIMS成像分析仍然面临着诸多挑战。激光扫描共聚焦显微成像(LSCM)作为一种单细胞成像技术已日趋成熟,可以对单细胞中的荧光分子或者对荧光标记的目标分子、细胞器成像,获得高分辨率亚细胞结构成像图。因而,LSCM在单细胞形貌分析上的优势和SIMS在单细胞化学成像方面的优势可以有效互补,其联合应用能显著提升单细胞分析的应用范围、深度和结果的准确性。本文重点介绍SIMS成像以及SIMS-LSCM联用成像在单细胞成像研究中的应用进展,在总结、评述该领域代表性工作的同时,对SIMS-LSCM联用成像在化学和生命科学研究,特别是在细胞生物学和药物发现领域的应用前景进行了展望。

激光共聚焦显微术在中药与天然药诱导肿瘤细胞凋亡研究中的应用

激光扫描共聚焦显微术因其具有成像分辨率高,可实现对活性细胞动态定量测量及三维重建等优势,用于中药与天然药诱导肿瘤细胞凋亡的研究中,包括以下几个方面:肿瘤细胞细胞核变化观察;细胞内钙离子浓度测定;线粒体膜电位测量;凋亡相关基因表达等。

肿瘤坏死因子诱导内皮细胞Ca^(2+)时空变化的激光共聚焦显微测定

目的 研究肿瘤坏死因子 (TNFα)对培养的单个内皮细胞内游离Ca2 +浓度 [(Ca2 )i]的影响 ,以探讨TNFα介导休克的细胞机制。方法 人脐静脉内皮细胞株 (ECV30 4 )接种于 35mm含有 2mlDMEM培养基的组织培养盘中培养。TNFα诱导的单个内皮细胞 [Ca2 +]i时空变化由激光扫描共聚焦显微系统 (LSCM)和Fluo - 3/AM荧光探剂标记技术测定。结果 TNFα使单个内皮细胞 [Ca2 +]i呈剂量依赖性升高 ,在 60s内达到峰值 ,然后下降并保持在基础水平之上。共聚焦扫描图像显示细胞核区 [Ca2 +]i升高比胞浆区明显 ,下降比胞浆区慢。结论 TNFα显著诱导内皮细胞 [Ca2 +]i升高 ,可能是TNFα介导休克和组织损伤的重要机制之一。

基于激光扫描共聚焦显微技术的烤烟叶面组织粗糙度参比样研究和应用

为量化表征初烤烟叶面组织粗糙度,选用玉溪烟区K326品种为试验材料,采用感官分析技术与激光扫描共聚焦显微技术相结合的方法,对符合粗糙度参比样原则的样品进行筛选分档和感官分析,观测初烤烟叶面的微观形貌和粗糙度参数(Sa),并应用心理物理学定律验证参比样的合理性,最后探讨不同烤烟品种中部烟的叶面组织粗糙度差异。结果表明:烟叶表面存在大量的嵴状隆起区域,根据隆起程度可将粗糙度分为细腻、较细腻、稍细腻、中等、稍粗糙、较粗糙和粗糙7个档次,其粗糙度参数(X)分别为2.95、3.60、4.54、5.56、6.67、8.26、10.34μm。粗糙度感官标度值的自然对数(Y)与仪器测量值Sa的自然对数之间存在线性关系:Y=1.85 X-1.37(r^2=0.89),符合心理物理学定律。中烟100叶面组织粗糙度最大,翠碧1号叶面组织粗糙度最小且叶表面隆起有直径41.26μm、高16.83μm的中空圆柱体结构。

体外细胞培养中甲肝病毒的连续传代及激光扫描共聚焦成像

观察甲肝病毒(HAV)在体外细胞培养中连续传代的特点及细胞内病毒荧光的激光扫描共聚焦成像。实验中采用了间接免疫荧光法(IF)与激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)结合技术,并与ELISA进行比较。LSCM技术发现将NJ-3株HAV接种于PLC/PRF/5细胞1 h后细胞表面有病毒吸附,2-4 h病毒吸附量增多,4 h后逐步减少。在病毒随细胞连续传代中,至第7代病毒增殖量可达到稳定状态并至少可连续传77代,感染病毒的细胞可达95％以上;细胞传代或病毒收获的最佳周期为5 d;经多次冻存、复苏,仍保持良好的细胞形态和产毒性能。结果表明LSCM技术能更早地检出细胞表面吸附的少量病毒和胞浆内微弱的HAAg荧光,而ELISA则需要较多量病毒才能显示阳性。提示前者更适合于少量病毒时的定性,特别是在初次病毒分离时;后者则适合于病毒量较多时的整体定量。

运动性肥大心肌活细胞胞浆游离Ca^(2+)动态变化的激光共聚焦研究以及局部IGF-Ⅰ和AngⅡ的变化

目的 :研究运动与心脏重塑过程中心肌胞浆游离Ca2 +([Ca2 +]c)动态变化的生物学机制。方法 :采用激光扫描共聚焦显微技术 (LSCM)对STDInCa2 +荧光试剂负载的运动肥大心肌活细胞 [Ca2 +]c 动态变化进行研究 ,采用放射免疫测定运动小鼠心肌局部IGF -Ⅰ和AngⅡ含量。结果 :运动肥大心肌 [Ca2 +]c 变化表现为基值稳态和峰值显著升高 ,达峰时间延长 (P <0 0 0 1)。心肌局部IGF -Ⅰ和AngⅡ显著升高 (P <0 0 0 1)。结论 :运动性心肌肥大与 [Ca2 +]c 变化、机械信号、IGF -Ⅰ和AngⅡ关系密切 ,机械信号、IGF -Ⅰ和AngⅡ可能是引起 [Ca2 +]c 显著升高 ,增强心肌收缩能力的胞外刺激因素。

激光扫描共聚焦显微镜在电子材料研制中的应用

介绍了激光扫描共聚焦显微(Confocal laser scanning microscope,CLSM)的工作原理及技术优势,比较了CLSM与光学显微镜以及SEM的优劣,阐述了CLSM在太阳能电池、透明陶瓷等材料研制中的应用。

阔口尖毛虫纤毛器微管的激光共聚焦显微镜观察

应用激光扫描共聚焦显微术显示经荧光紫杉醇标记的阔口尖毛虫(Oxytricha platystoma)口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛等纤毛器的微管类细胞骨架。其口围带基部含小膜托架、托架间连接微管和小膜基部微管束,波动膜基部含发达的微管骨架网,口围带和波动膜后端的汇合处含有口底托架及口后微管束,额腹横棘毛和左、右缘棘毛基部含前纵微管束、后纵微管束、横微管束或周围微管束。结果表明,阔口尖毛虫的纤毛器基部微管具有其种的特异性,尤其是波动膜在其特长的纤毛列基部形成发达的微管骨架网,这种巨大型波动膜及其基部微管骨架在尖毛科乃至其他腹毛类纤毛虫中未见报道;且本文所见的纤毛虫口底托架及口后微管束可能是腹毛类纤毛虫中普遍存在的口纤毛器基部微管结构。