激光捕获显微切割技术在膀胱移行细胞癌相关基因研究中的应用

背景与目的 :激光捕获显微切割技术 (LCM)是获取均一目的细胞的有效方法。利用LCM技术从膀胱粘膜中分离膀胱移行上皮细胞从肿瘤间质细胞中分离膀胱癌细胞 ,进行RNA提取、纯化、浓缩以备进一步研究。方法 :采用LCM技术分别从正常膀胱粘膜及膀胱癌组织冰冻切片中获取膀胱移行上皮细胞及膀胱癌细胞 ,提取RNA ,并对微量RNA进行纯化、浓缩。然后用RT PCR验证TotalRNA中β actin基因表达水平。结果 :对照实验Ⅰ证实经LCM后RNA完整性较好 ;经对照实验Ⅱ初步确定设定条件下LCMshooting次数与可获得RNA量间对应关系。从膀胱粘膜中捕获膀胱移行上皮细胞 2 5万shootings;从膀胱癌组织中获取癌细胞 2 0万shootings。经RT PCR验证β actin基因表达表达完整。结论 :使用LCM技术能成功地获取较为均一的研究目的细胞 ,RNA完整性较好 ,能用于进一步研究中。

激光捕获显微切割技术结合^(18)O标记定量蛋白质组技术在胃癌标志物筛查中的应用研究

建立一种更加精确地分离鉴定胃癌特异肿瘤标志物的定量蛋白质组学技术.首先采用激光捕获显微切割技术(LCM)纯化胃腺癌细胞及胃黏膜良性上皮细胞,将裂解的样本总蛋白经过1DSDS-PAGE预分离,然后采用18O/16O分别标记两种样本酶切后的多肽混合物.结合纳升级液相色谱(Nano-HPLC-MS/MS)定量地鉴定胃癌细胞和胃黏膜良性上皮细胞的差异表达蛋白.共筛选出78个差异表达蛋白,其中42个蛋白质在胃癌组织中表达上调,36个蛋白质下调.Western blot技术验证了其中几个差异蛋白(moesin,periostin,annexin A2,annexin A4)的表达,与蛋白质组学研究的结果一致.LCM技术结合18O稳定同位素标记的定量蛋白质组学技术,为研究胃癌发生机制、筛选胃癌的分子标志物提供了新的思路,亦为诸如胃癌等复杂体系蛋白质的分离鉴定提供了新的技术选择.

激光捕获显微切割技术用于分离混合斑中精子细胞

目的评估激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术在分离混合斑中少量精子细胞的应用价值。方法配制不同比例的精液-阴道上皮细胞混合液,分别用差异裂解法和LCM法分离精子细胞,用磁珠法提取精子细胞DNA,并用IdentifilerTM试剂盒进行STR基因型检测。结果 LCM法分离精子细胞的STR成功率为92.86%(13/14),采用差异裂解法检测的成功率为7.14%(1/14),二者差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LCM法可有效排除女性细胞成分的干扰,并捕获少量精子细胞得到单一的男性STR分型,显著优于差异裂解法。

激光捕获显微切割-单细胞PCR技术的应用研究

目的建立一套优化的激光捕获显微切割一单细胞聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术，应用于分子组织学研究中单细胞基因的检测。方法从淋巴结反应性增生冷冻组织切片中，应用激光捕获显微切割获取1～10个淋巴细胞，采用优化的单细胞PCR反应体系和条件进行β-珠蛋白基因检测。结果单轮常规PCR各组多细胞的扩增阳性率比较无显著性差异（P〉0．05），而单细胞的扩增阳性率低于各组多细胞，有显著性差异（P〈0．01）；半巢式降落式PCR的单细胞扩增阳性率高于单轮常规PCR，有显著性差异（P〈0．01）。结论联合应用优化的激光捕获显微切割及半巢式降落式PCR技术，显著提高了单细胞PCR的敏感性、特异性和稳定性。

激光捕获显微切割技术在植物基因组研究中的应用

植物的生长和发育在很大程度上取决于组织和(或)器官特异表达的基因,但要获取某一发育阶段的特异细胞类群来进行基因表达分析又是相当困难的。近年发展起来的激光捕获显微切割技术可以在显微镜下快速准确地获取单一的细胞类群,甚至单个细胞,成功地解决了组织中细胞的异质性问题。介绍了该技术的原理,并对其在植物中的应用进展情况做了综述,同时指出了该技术在植物中应用的可能发展方向。

导向激光捕获显微切割技术在贲门腺癌差异蛋白质组学的应用研究

目的建立一套适用于贲门腺癌差异蛋白质组学研究的导向激光捕获显微切割技术(navigated laser capture microdissection,NLCM)方法,并探讨其可行性。方法比较染色剂和固定剂对蛋白质影响的差异,探讨不同处理条件下贲门腺癌和癌旁组织切片的镜下组织学特点,改进常规LCM,建立在染色切片指引下分离细胞的NLCM技术,并通过双向凝胶电泳分析对该技术进行评价。结果染色剂对蛋白质的影响大于700mL/L乙醇固定剂;光镜下在不染色的组织切片上,贲门腺癌细胞、肠化生细胞和正常柱状上皮细胞都有其各自的形态特异性,易于辨认;NLCM可以准确纯化贲门腺癌细胞、肠化生细胞和正常柱状细胞;LCM的苏木素染色贲门腺癌细胞(A组)、NLCM的无染色贲门腺癌细胞(B组)和未切割的新鲜贲门腺癌组织(C组)的双向电泳表达图谱非常相似。各组蛋白质点的数量之间差异无统计学意义(P>0.05)。A组碱性端蛋白等点聚焦较差,部分蛋白质点的表达量减低或消失,B组双向电泳表达图谱蛋白质点分离较好。结论 NLCM不但可以快速、准确地将贲门腺癌及其癌前病变细胞进行分离,而且有效避免了染色剂对蛋白质提取质量的影响,是一项适用于贲门腺癌蛋白质组学研究的样品制备方法。

激光捕获显微切割技术应用研究新进展

对疾病发生过程中的组织损害要进行分子水平分析,首要步骤就是纯净目标细胞的分离。近年发展起来的激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCM)技术可以在显微镜直视下快速、准确地获取所需的单一细胞亚群,甚至单个细胞,从而成功解决了组织中细胞异质性问题。本文介绍了LCM技术的原理及其优缺点,并对其在DNA分析和基因表达分析两个方面的应用研究新进展进行综述,同时对LCM技术的发展和完善提出了可能的方向。

应用激光捕获显微切割和蛋白质组学技术筛选鼻咽癌的差异表达蛋白质

目的:筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的差异表达蛋白质,为寻找NPC的分子标志物提供科学依据。方法:采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)分别从NPC组织和正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngeal epithelial tissue,NNET)中纯化NPC细胞和正常鼻咽上皮细胞(normal nasopharyngeal epithelial cells,NNEC),应用二维凝胶电泳(2-DE)分离LCM纯化细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western印迹和组织芯片(tissue microarray,TMA)免疫组织化学验证差异蛋白鳞状细胞癌抗原1(SCCA1)在两种组织中的表达水平。结果:建立了LCM纯化的NPC细胞和NNEC的2-DE图谱,质谱鉴定了36个差异蛋白质,其中20个蛋白只在NPC表达或表达上调,16个蛋白在NPC中表达下调或缺失。Western印迹和组织芯片免疫组织化学结果显示:SCCA1在NPC中的表达水平较NNET明显下调,与比较蛋白质组学结果一致。结论:36个差异蛋白可能与NPC的发病有关,为筛选NPC分子标志物奠定了基础。

激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞的比较蛋白质组学研究

为筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的分子标志物,采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)分别从NPC组织和正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngal epithelial tissue,NNET)中切割纯化NPC细胞和正常鼻咽上皮细胞(normal nasopharyngal epithelial cells,NNEC),应用二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分离LCM纯化细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western blot检测差异蛋白cytokeratin8(CK8)在LCM纯化的NPC细胞和NNEC以及具有不同分化程度或转移潜能的4株NPC细胞中的表达,免疫组织化学检测CK8在63例NPC、28例NNET及20例颈淋巴结转移NPC组织中的表达水平.建立了LCM纯化的NPC细胞和NNEC的2-DE图谱,质谱鉴定了29个差异蛋白质,其中15个蛋白质只在NPC表达或表达明显增高,14个蛋白质在NPC中表达下调或缺失;Western blot结果显示,CK8的表达水平在NPC中较NNET明显下调,并与NPC细胞株的分化程度和转移潜能有关;免疫组织化学结果显示,CK8在NPC组织中的表达较NNET明显下调,在颈淋巴结转移NPC中的表达较原发NPC明显上调.研究结果提示,CK8与NPC分化及淋巴结转移相关,有望成为预测NPC转移和区别NPC分化程度的分子标志物.

激光捕获显微切割和基因芯片技术用于肿瘤实质细胞转录组的构建

目的：联合应用激光捕获显微切割和基因芯片技术构建纯化肿瘤实质细胞转录组。方法：应用激光捕获显微切割技术从肿瘤组织冰冻切片中获取纯化肿瘤实质细胞，提取RNA并对其进行线性扩增得到aRNA，合成cRNA探针后与全基因组基因芯片Affymetrix HG—U133．Plus 2．0 Gene—Chip杂交构建全基因组表达谱。结果：从5例结肠癌组织样本中各获取了3mm。细胞，抽提获得RNA118．4～300．3ng，混合后取100ng进行线性扩增获得aRNA 7ug。基因芯片各项质控标准符合基因表达谱芯片操作指南，共有18205条转录本表达，代表15276个基因。结论：联合应用激光捕获显微切割和全基因组基因芯片技术可构建纯化肿瘤实质细胞转录组。

应用激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌蛋白质表达谱的建立

目的:建立鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究奠定基础。方法:应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术从NPC组织纯化NPC细胞,应用二维凝胶电泳(2-DE)分离LCM纯化NPC细胞的蛋白质,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质,利用生物信息学资源构建NPC的2-DE蛋白质组数据库。结果:建立了NPC蛋白质2-DE参考图谱,2-DE图谱共显示(1312±30)个蛋白质点,共鉴定了427个蛋白质点,包括241个非冗余蛋白质,并构建了NPC的2-DE蛋白质组数据库,这些数据可从本实验室网站(http://www.xyproteomics.org)上进行查询。结论:首次建立了LCM纯化NPC细胞2-DE蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究提供了重要的信息和资料。

激光捕获显微切割技术新进展

激光捕获显微切割是一种先进的分离特定同质细胞群进行进一步研究的技术,尤其是在需要研究的细胞占样本细胞数很少时,以及需研究的细胞呈散在分布时,激光捕获显微切割的重要性尤为明显。与免疫组织化学、原位杂交技术、高通量基因分析、蛋白分析技术结合,显微切割技术显示出良好的发展前景。本文简述激光捕获显微切割的基本原理、应用以及可能的发展趋势。

激光捕获显微切割技术及其在脑研究中的应用

激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCM),是一项利用激光在显微镜下从组织切片中分离单一类型细胞群的技术。以LCM技术为基础,结合蛋白质、核酸等分子生物学研究方法进行基因诊断、表达谱或蛋白质组学的研究,从根本上解决了细胞异质性问题。本文就LCM技术在脑科学中的应用及所涉及到的脑组织固定、切片、染色、捕获等关键环节做一综述。

激光捕获显微切割技术应用于子宫内膜癌相关基因的研究

目的:摸索一条可行的技术路线,运用激光捕获显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM)获取无间质混杂的人正常子宫内膜腺管上皮细胞与子宫内膜癌细胞,用于进行子宫内膜癌相关基因差异表达的研究。方法:采用LCM技术分别从正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞,提取微量RNA,并对微量RNA进行纯化及浓缩,用RTPCR验证捕获细胞RNA中β-actin基因表达水平。结果:分别从冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞各50000Shootings。对照实验Ⅰ、Ⅱ证实经LCM后RNA完整性较好。确定了LCMShooting次数与可获得RNA量间对应关系。捕获细胞所提取的RNA中βactin基因表达完整。结论:通过LCM技术可以从冰冻切片中捕获单一类型的目的细胞,此过程不会造成细胞RNA明显降解,可以应用于下游的实验研究。

激光捕获显微切割技术及其在植物研究中的应用

若要获得植物特定类型细胞的准确信息,首要的是获得同质的目标细胞。近年发展起来的激光捕获显微切割技术能够在显微镜下准确、快捷地获得所需要的目标细胞群甚至是单个细胞,从而成功地解决了组织中细胞异质性问题。文章概述了激光捕获显微切割技术的原理、注意的问题以及在植物科学研究中的应用和前景。

激光捕获显微切割技术检测卵巢癌组织中EphA2受体的表达

目的:检测卵巢癌组织中EphA2受体mRNA及蛋白的表达水平。方法:应用激光捕获显微切割技术(LCM)辅助的一步RT-PCR及Western blot方法检测30例卵巢癌组织中EphA2受体mRNA及蛋白的表达水平。结果:LCM成功地将卵巢癌细胞从卵巢癌冰冻组织切片中分离。RT-PCR结果显示,卵巢癌组织中有不同级别的EphA2受体mRNA表达,mRNA表达与卵巢癌患者的年龄、FIGO分期、组织学类型、组织分化程度以及残余肿瘤大小均无关(P>0.05)。Western blot结果显示EphA2受体表达与mRNA表达水平一致。结论:LCM能够精确分离少量卵巢癌细胞;卵巢癌组织中有不同级别的EphA2受体mRNA及蛋白质表达。

激光捕获显微切割技术纯化的肺鳞癌原发灶与淋巴结转移灶肿瘤细胞的比较蛋白质组学

目的:筛选肺鳞癌淋巴结转移相关的蛋白质。方法:采用激光捕获显微切割技术(lasercapture microdissection,LCM)分别从肺鳞癌原发灶组织和匹配的淋巴结转移灶癌组织中切割纯化鳞癌细胞;应用二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分离LCM纯化细胞的蛋白质;图像分析识别差异表达的蛋白质点;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异蛋白质点,Western印迹验证差异蛋白Rho-GDIα在LCM纯化的肺鳞癌原发灶肿瘤细胞(lung primary tumor cells,LPTC)和匹配的淋巴结转移灶肿瘤细胞(lymph node metastatic tumor cells,LNMTC)中的表达。结果:建立了LCM纯化的LPTC和匹配的LNMTC的2-DE图谱,质谱鉴定了22个差异蛋白质,与LPTC相比,8个蛋白质在LNMTC中表达明显增高。结论:22个差异蛋白可能与肺鳞癌淋巴结转移有关,为筛选肺鳞癌转移标志物奠定了基础。

应用激光捕获显微切割技术制备肺癌蛋白质组学研究样品

目的探讨应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术获取高同质性肺癌组织细胞及正常对照肺泡上皮细胞的方法及可行性。方法将新鲜肺癌组织标本及其配对正常组织常规制备8μm冰冻切片,采用改良的HE方法染色;应用LCM技术大宗切割肺鳞癌、腺癌及正常对照肺泡上皮细胞;选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞。结果通过LCM技术可以准确、快速地分离癌细胞、间质及其他坏死组织,得到同质性不低于95%的肿瘤细胞和正常细胞。按照Duration 15.5 s的激光脉冲频率和平均8 000 shots条件,既可保证每个帽子的细胞收集数量,也能够有效地缩短实验时间,提高实验可控性,从而使操作过程标准化。结论应用LCM技术可以成功获取同质肺癌细胞和正常细胞。其所需标本量少、组织同质性高、操作过程稳定、可控性好,是肺癌分子生物学及蛋白质组学研究有价值的样品制备方法。