基质辅助激光解吸附电离质谱成像技术在帕金森病研究中的应用

基质辅助激光解吸附电离质谱成像(MALDI-MSI)技术是一种基于质谱检测的成像技术,可以无标记地在生物样品组织上同时检测多种物质的分布情况。目前,MALDI-MSI越来越多地用于分子水平的中枢神经系统疾病研究,包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症和脑卒中等。本文就MALDI-MSI在帕金森病研究中的应用情况进行综述,为定位帕金森病发展过程中小分子代谢产物的功能障碍途径提供信息,为研究其治疗策略的潜在机制提供参考。

基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱研究重组人促红细胞生成素一级结构

建立了生物质谱研究rhEPO一级结构的系列方法,包括分子量、唾液酸含量以及N-糖含量等糖基化性质的测定方法,并用于4种国产rhEPO样品的分析;在此基础上优化酶切条件,使测定的肽质量指纹谱(PMF)的覆盖率均达到98%,成功鉴定了4个样品中的全部N-糖基化位点以及对分子中两对二硫键进行了结构确证,测定4个样品分子量分别为27754.1±27.4Da、27941.4±23.2Da、27682.5±22.0Da和27914.7±22.5Da;唾液酸含量分别为5.0%、4.8%、5.6%和5.4%;糖含量分别为34.3%、34.7%、34.1%和34·6%。此外还对4种产品在O-连接糖型及N-连接糖型上的区别做了初步探讨。

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱在临床病毒学中的应用

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种新型的微生物鉴定技术,具有准确、快速、高通量等特点,目前在细菌和真菌的鉴定方面已比较成熟,但在病毒方面应用较少。本文从病毒的诊断、分型及耐药基因检测3个方面对MALDI-TOF MS在临床病毒学中的应用作一综述。

基于吸光材料的激光解吸附离子化质谱用于纺织品快速筛查

建立了基于微纳吸光材料的激光解吸附离子化质谱法快速检测纺织品中有害物质邻苯二甲酸酯、乙醇胺和己内酰胺。以不锈钢板为基底,利用激光加工技术获得微纳吸光材料,可将紫外激光能量高效转化为热能,实现材料表面待测物的解吸附和离子化,并进行质谱分析。为考察方法的定量能力,采用内标法定量分析邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二乙酯,结果表明,二者分别在10~200、10~150μmol/L浓度范围内呈现较好的线性关系。该方法无需繁琐的样品前处理,在1 min内即可完成待测样品的快速质谱分析,且灵敏度高、溶剂消耗少,适用于纺织品中有害物质的快速、高通量筛查。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对分枝杆菌液体培养系统菌种鉴定的临床研究

目的应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)对Bactec^(TM) MGIT^(TM) 960液体培养出的阳性培养物进行高通量、快速、准确的菌种鉴定,为临床早期、精准治疗提供病原学依据。方法选取我院Bactec^(TM) MGIT^(TM) 960分枝杆菌快速液体培养的阳性培养物为研究对象,通过不同的孵育时间、不同大小的研磨珠处理、不同的破壁方式摸索出MALDI-TOF MS对Bactec^(TM) MGIT^(TM) 960阳性培养物鉴定的"最优处理方法",并将所有结果与基因芯片法菌种鉴定做参照进行比对,鉴定不一致的结果通过基因测序确认。结果Bactec^(TM) MGIT^(TM) 960液体培养报阳性后增加孵育时间可提高检出率及鉴定分值,同时使用0.5 mm的氧化锆珠研磨,使用超声震荡混匀处理,鉴定效果最佳。鉴定结果方面,液体系统报阳的420份阳性标本,基因芯片法鉴定结果为结核分枝杆菌占69.05%(290/420),非结核菌占28.81%(121/420),9例未鉴定出,未鉴定占2.14%(9/420),错误鉴定占0.95%(4/420),总鉴定率为97.86%(411/420);采用MALDI-TOF MS质谱鉴定420份阳性标本中鉴定出419例,其中结核分枝杆菌占69.05%(290/420),非结核占30.00%(126/420),星型奴卡菌0.48%(2/420),巴西奴卡菌占0.24%(1/420),1例未鉴定出,总鉴定率为99.76%。质谱鉴定分值≥2.0的400例占95.24%,分值在1.7~2.0的19例占4.52%,分值<1.7的1例占0.24%。结论本实验实现了Bactec^(TM) MGIT^(TM) 960液体培养阳性培养物的直接质谱鉴定,缩短了培养鉴定的时间,将分枝杆菌鉴定到种水平,能区分出结核菌与非结核菌,同时也能将与分枝杆菌相似的奴卡菌鉴定出来,对临床疾病的鉴别诊断起到了积极的作用。

应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析宫颈鳞癌早期浸润蛋白质

目的探讨基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization ti me of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)对宫颈鳞癌(squamous carcinoma of thecervix,SCC)组织切片直接分析,获取宫颈鳞癌早期浸润的分子标志物的有效性。方法利用超微量点样枪将化学基质直接点样到宫颈鳞癌组织切片上,然后利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱直接扫描宫颈鳞癌组织切片,分析宫颈鳞癌组织蛋白质分子。结果获得的25种蛋白质质谱峰强度比较,差异有显著意义(P<0.05)。其中7种差异蛋白质有分类意义,其质/核(M/Z)分别为:m/z3433,m/z4786,m/z10092,m/z10835,m/z15114,m/z15854和m/z16345。差异蛋白质m/z3433,m/z15114,m/z15854在宫颈鳞癌鳞状上皮组织高度表达,可作为宫颈鳞癌早期诊断的标志蛋白;差异蛋白质m/z16345在宫颈鳞癌的间质组织高度表达,可作为宫颈鳞癌早期间质浸润和扩散诊断的标志蛋白。结论利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术成功获取一组差异蛋白质。该差异蛋白组可望作为宫颈鳞癌早期诊断的标志蛋白。

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术对痤疮患者痤疮丙酸杆菌的鉴定

目的了解基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术鉴定痤疮丙酸杆菌的效果。方法应用MALDI-TOF MS技术对痤疮患者皮损分离的91株菌株进行鉴定。结果 70株为痤疮丙酸杆菌,19株为其他厌氧菌或兼性厌氧菌(表皮葡萄球菌8株、颗粒丙酸杆菌3株、头状葡萄球菌2株、蜡样芽胞杆菌1株、产芽孢梭状芽孢杆菌1株、贪婪丙酸杆菌1株、克氏柠檬酸杆菌1株、毗邻颗粒链菌1株、结核硬脂酸棒状杆菌1株),2株无鉴定结果。结论 MALDI-TOF MS技术鉴定痤疮丙酸杆菌快速而准确,值得选用。

运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术建立鼻咽癌特异血清多肽谱诊断模型

目的探讨鼻咽癌患者与正常健康者血清蛋白谱的差异，建立特异的鼻咽癌血清多肽谱诊断模型。方法收集治疗前的鼻咽癌患者和正常健康对照者的血清标本，通过特异的液体磁珠分选后，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOFMS）分析，得到鼻咽癌患者的血清多肽谱。采用专用的生物信息学分析软件ClinProt^TM进行差异分析，运用遗传算法，建立鼻咽癌的血清多肽谱诊断模型。通过盲法检验模型的灵敏度和特异度。结果检测出鼻咽癌患者与正常健康者的差异蛋白峰有99个，选取两组间差异有统计学意义的、相对分子质量为808．99、834．61、3954．82和8141．88的蛋白峰，建立鼻咽癌诊断模型，该模型鼻咽癌的识别率为90．0％，预测能力为84．3％，盲法检验模型的灵敏度为80．0％，特异度为64．0％。结论鼻咽癌患者与正常对照者的血清间存在蛋白表达的差异，建立的特异的血清多肽谱诊断模型在鼻咽癌的诊断中有一定的应用前景，为寻找特异的鼻咽癌血清肿瘤标记物提供了一定的依据。

黑木耳核糖体失活蛋白的质谱分析

目的:对悬浮培养黑木耳菌丝体中分离纯化得到的核糖体失活蛋白进行质谱分析,测定其肽的指纹图谱。为用5′-RACE与3′-RACE方法,克隆和表达核糖体失活蛋白的基因,设计5′和3′末端的PCR引物。方法:使用HPLC和MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析方法。结果:测定出肽的指纹图谱及三个随机肽段的氨基酸序列。结论:可根据所测肽段氨基酸序列设计5’-和3’-RACE的引物。

重组人白细胞介素13的二硫键解析

目的解析重组人白细胞介素13的二硫键连接方式。方法本研究根据氨基酸序列的特点,设计了胰酶(Trypsin)和胰凝乳蛋白酶(α-Chymotrypsin)的复合的酶切方式,液相分离结合MALDI质谱鉴定分析了重组人白细胞介素13的二硫键定位。结果实验样品中的主要二硫键连接方式为Cys28/Cys56,Cys44/Cys70,与文献报道的白细胞介素13的理论连接方式一致。结论本研究为白细胞介素13的二硫键连接方式的质量控制提供了有效的方法,也为其它多肽/蛋白的二硫键定位研究提供思路。

MALDI-TOF质谱准内标法及其用于rhTPO复杂糖一致性研究

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)准内标法准确测定重组人血小板生成素(rhTPO)仿制药和原研药中4类糖修饰的相对含量,并进行样本间和批间一致性比较。结合多种切糖酶逐步切除rhTPO的N-糖、唾液酸和O-糖;以牛血清白蛋白(BSA)为标准品,与样本非混合点靶;采用MALDI-TOF质谱准内标法检测,分别获得各样本完整含糖分子量及不同层次切糖后分子量;通过分子量差值计算4类糖修饰的相对含量;最后比较仿制药与原研药样本间和批间一致性。以BSA多电荷峰对rhTPO切糖前后的MALDI-TOF质谱测定值进行准内标法校正,BSA多电荷峰之间相对标准偏差(RSD)均≤0.075%,批间RSD为0.001%~0.004%,方法误差均<0.01%。rhTPO仿制药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为24.6%、2.9%、9.0%和5.1%,批间一致性良好,且总糖含量与文献值一致;rhTPO原研药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为25.6%、2.9%、7.9%和3.5%,总糖含量较文献值偏低。与rhTPO原研药相比,仿制药糖基化糖相对含量基本一致,糖化糖含量有差异。rhTPO糖化糖研究未见文献报道,其差异是不同厂家rhTPO之间差异的重要因素,主要由发酵工艺差异导致。

红细胞生长刺激蛋白二硫键定位连接方式的测定

目的:建立红细胞生长刺激蛋白(ESP)的二硫键连接方式的测定方法。方法:先将红细胞生长刺激蛋白的糖链用糖苷酶切除,再分别对ESP和还原烷基化后ESP用胰蛋白酶进行酶切,然后用MALDI-TOF测得该蛋白质的肽质量指纹图谱,通过比较还原烷基化前后各肽质量指纹图谱,找到差异肽段的分子离子峰[M+H]+,通过比对该蛋白理论酶切肽的[M+H]+,确定二硫键的连接方式。结果:ESP有4个半胱氨酸,通过比较还原烷基化前后的肽质量指纹图谱定位二硫键的位置为Cys7-Cys161和Cys29-Cys33,与理论上的二硫键连接相符。结论:建立了酶切结合质谱法测定蛋白质二硫键定位的方法,为今后生物技术产品的二硫键连接方式的质量控制提供了有效的方法。

犊牛卵泡液多肽信息分析

【目的】了解成年牛和犊牛卵泡液中多肽的信息表达差异,为完善犊牛卵泡液基础研究及犊牛卵母细胞体外培养体系奠定基础。【方法】采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对超排成年牛和超排犊牛卵泡液中的肽段进行分析,根据多肽的信号峰信息,通过MASCOT数据库进行蛋白检索。【结果】从成功构建的成年牛与犊牛卵泡液质谱多肽信号峰模型图谱可知,超排犊牛卵泡液多肽表达图谱中有60～80个信号峰,而超排成年牛的有30～40个信号峰;其中成年牛卵泡液有两个特有信号峰,质荷比为1218.58和1509.77 m/z,犊牛有1个特有信号峰,质荷比为953.54 m/z。利用MASCOT数据库对获得的卵泡液多肽信息进行蛋白检索,发现成年牛卵泡液中有18种蛋白,犊牛卵泡液中有11种蛋白。【结论】犊牛卵泡液中蛋白多肽信息峰数量多于成年牛,但卵泡液中总蛋白数量少于成年牛,这种差异可能是导致犊牛卵母细胞发育能力低于成年牛的重要原因之一。

SELDI-TOF-MS在细胞信号转导通路研究中的应用进展

真核细胞的一个重要特征是具有复杂的信号转导系统。细胞通过其膜表面或胞内具有感受器样效应的蛋白与相应的信号分子结合而发挥信号转导子作用,调控细胞的增殖与分化。由于细胞信号转导通路错综复杂,传统的研究技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳、抗体免疫沉淀、RNA干扰等无法满足大规模的检测和鉴定信号传递过程中差异表达的信号分子及关键蛋白的磷酸化。表面增强的激光解吸附／电离飞行时间质谱技术（SELDI．TOF．MS）是近年开发的蛋白质组研究技术之一，具有高灵敏性、高通量、快捷、实时监测等特点，是能从整体水平探索细胞蛋白质作用模式、功能机制、

SNCA基因内含子区多态性rs3857059与中国散发性帕金森病的关联研究

目的探究SNCA基因rs3857059位点的单核苷酸多态性(SNPs)与中国人群散发性帕金森病(PD)发病风险及临床症状的关联。方法采用病例-对照研究,收集南京地区PD患者171例为PD组;另选择健康者197例为对照组。应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测基因SNPs。结果 PD组SNCA基因rs3857059位点G等位基因频率显著高于对照组(OR=1. 49,95%CI:1. 11～2. 00,P=0. 008),携带GG基因型增加PD的发病风险(OR=2. 17,95%CI:1. 18～4. 00,P=0. 013),男性GG型PD患者易感性高于女性,但与临床症状无关联。结论SNCA基因rs3857059位点的SNPs与中国人群散发性PD易感性有关。