MiR-145靶向作用激活素受体ⅠB抑制小鼠卵巢颗粒细胞增殖

目的探讨miR-145对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的调控作用。方法制备Ad-miR-145重组腺病毒,分离培养3周龄的SPF级ICR雌性小鼠卵巢颗粒细胞(mGC),以不同浓度的Ad-miR-145(0 mol、50 mol、100 mol)感染m GC,48 h后通过CCK-8增殖实验检测细胞的增殖活力;收集细胞通过TRIZOL法提取细胞总RNA,反转录后进行实时定量PCR检测细胞增殖相关基因细胞周期蛋白cyclin D2 mRNA的表达情况;提取细胞蛋白,通过Western blot检测其中cyclin D2的蛋白水平;同时采用双荧光素酶报告基因调查miR-145对其预测靶基因激活素受体ⅠB(ACVRⅠB)的调控作用。结果成功获得滴度为8.91×10^(10) ifu/mL的高表达miR-145腺病毒,该腺病毒可在mGC中高表达miR-145;腺病毒介导的miR-145高表达可抑制m GC的增殖活力,并可抑制m GC中cyclin D2的m RNA和蛋白的表达;miR-145可抑制ACVRⅠB 3’-UTR的荧光素酶活性。结论 miR-145通过靶向作用ACVRⅠB抑制小鼠m GC增殖。

微小RNA-210-3p靶向ACVR1B抑制结直肠癌细胞的增殖和转移

目的探讨微小RNA-210-3p(miR-210-3p)在结直肠癌细胞中的表达以及对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法体外培养人结直肠癌细胞系RKO、SW480、SW620、DLD1和人正常结肠上皮细胞系NCM460。将miR-210-3p抑制剂(inhibitor)及inhibitor阴性对照(NC)转染于RKO细胞中, 设为miR-210-3p inhibitor实验组以及NC组。使用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-210-3p表达水平。采用细胞计数实验(CCK-8)和平板克隆实验检测细胞增殖活性。划痕愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞的迁移及侵袭能力。qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测激活素A的ⅠB型受体(ACVR1B) mRNA和蛋白的表达水平。两样本间比较采取t检验, 多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。结果 miR-210-3p在结直肠癌细胞系中表达均高于人正常结肠上皮细胞, 以RKO中升高最为明显(2.33±0.51、5.54±0.95、1.80±0.15、3.34±0.45比1.00±0.02, P<0.01), 差异有统计学意义。体外转染实验构建低表达miR-210-3p的miR-210-3p inhibitor实验组和NC组, qRT-PCR测量实验组miR-210-3p表达量低于对照组(0.44±0.04比1.02±0.27, t=3.26, P<0.05), 差异有统计学意义。生物学实验验证miR-210-3p对结直肠癌细胞系的增殖、迁移和侵袭的影响。CCK-8表明, miR-210-3p inhibitor组24、48、72 h细胞吸光度明显低于NC组(0.33±0.01比0.41±0.01、0.51±0.01比0.72±0.03、0.80±0.02比1.01±0.08, t=0.378、17.900、23.920、5.494, P<0.05), 差异有统计学意义。平板克隆试验显示, miR-210-3p inhibitor组细胞集落个数明显少于NC组[(370.67±13.80)个比(518.67±11.50)个, t=14.270, P<0.05], 差异有统计学意义。细胞划痕愈合实验表明miR-210-3p inhibitor组划痕愈合度低于NC组[(7.91±0.55)%比(21.22±1.00)%, t=20.380, P<0.05]差异有统计学意义。miR-210-3p inhibitor组在Transwell迁移和侵袭实验中通过微孔膜的细胞数显著低于NC组[(145.00±5.67)个比(208.00±10.54)个, t=9.157, P<0.05;(122.33±8.02)个比(195.67±6.81)个, t=12.070, P<0.05], 差异有统计学意义。使用预测软件(miRDB、miRWalk和StarBase 2.0)预测, 并通过qRT-PCR及Western blot验证潜在靶点, 结果显示ACVR1B作为miR-210-3p靶基因位点调控结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭, miR-210-3p inhibitor组ACVR1B mRNA表达和蛋白表达倍数明显高于NC组, mRNA表达(2.00±0.03比1.00±0.11, t=14.540, P<0.05), 差异有统计学意义;蛋白相对倍数为[(67.89±0.65)%比(37.85±0.86)%, t=48.260, P<0.05], 差异有统计学意义。结论人结直肠癌细胞系中miR-210-3p显著高表达, 并通过靶向ACVR1B促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。