激活素相互作用蛋白5在急性肝损伤动物模型中的表达变化及意义

目的探讨激活素及激活素相互作用蛋白5(Act RIP5)在刀豆蛋白A(Con A)诱导动物的急性免疫性肝损伤进程中的表达变化及意义。方法 C57BL/6小鼠尾静脉注射Con A(15 mg/kg),分别于给药后不同时段分批次检测模型动物血清酶学改变、肝脏脾脏形态及指数变化、肝脏组织病理学改变,应用实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测激活素及Act RIP 5的表达变化。结果 Con A诱导的肝损伤模型血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酶转氨酶(AST)在给药后4 h开始升高,给药后24 h达到高峰,后逐渐下降,96 h仍未达到正常水平;小鼠脾脏指数自给药后2 h开始增加,24 h达到峰值,48 h开始下降,96 h恢复正常水平;肝脏指数自给药后24 h开始增加,48 h达到最大值后开始下降,96 h仍未恢复正常。形态学及病理学检测显示给药后4 h开始出现肝脏损伤,24~48 h损伤最严重,48 h后损伤开始修复,96 h仍未恢复至正常水平;q RT-PCR结果显示激活素在给药后2 h开始升高,8 h达峰值后开始下降,96 h降至正常水平;Act RIP5给药后4 h开始上升,8 h达到峰值后开始下降,96 h未降至正常水平。结论 Con A可诱导急性肝损伤,激活素及Act RIP 5的表达于肝损伤进展期异常升高,肝损伤恢复期下降并恢复至正常,提示激活素可能通过其肝内特异信号传导Act PIR5参与了Con A诱导的急性肝损伤。

非常规前折叠素RPB5相互作用蛋白的生物学功能及其在肝癌中的研究进展

非常规前折叠素RPB5相互作用蛋白(URI)是不依赖腺苷三磷酸(ATP)的分子伴侣复合体,在细胞增殖、分化、细胞周期调控、肿瘤及恶质病等生理和病理过程发挥着重要的调控作用。越来越多的研究指出URI在肿瘤疾病的发生发展、诊断、治疗和预后中发挥重要作用,可能是肿瘤疾病潜在的诊断、预后标志物和治疗靶标。该研究主要对URI的结构特点、生理病理学功能和其对肝细胞癌发生发展调控机制方面的研究进展进行综述,探讨URI在肝细胞癌中的研究价值。

小鼠激活素受体相互作用蛋白5的基因克隆

目的克隆新的小鼠激活素受体相互作用蛋白5(ActRIP5)基因。方法应用酵母双杂交技术,筛选出与激活素ⅡA型受体(ActRⅡA)相互作用蛋白的基因片段,再以此基因片段作为探针,从小鼠脑cDNA文库中钓取ActRIP5cDNA。采用哺乳动物细胞双杂交系统,进一步确定ActRIP5与ActRⅡA的相互作用。采用RT-PCR检测ActRIP5mRNA在组织中的转录。结果克隆的ActRIP5全编码基因长1839bp,编码145个氨基酸残基,与ActRⅡA具有特异结合作用。ActRIP5mR-NA在小鼠多种组织中均可检出。结论ActRIP5属于ActRIP家族新成员,可以与ActRⅡA相互作用。

抗激活素受体相互作用蛋白1抗体的制备及应用

目的:制备抗激活素受体相互作用蛋白1(ARIP1)抗体并探讨其应用。方法:在大肠杆菌BL21中表达GST-ARIP1融合蛋白,以该蛋白作为抗原免疫新西兰家兔,制备抗ARIP1的多克隆抗体。应用该抗体进行免疫组织化学染色,分析ARIP1在小鼠脑组织的分布。结果:制备的兔抗ARIP1多克隆抗体可以特异识别ARIP1,而与ARIP2无交叉反应。初步应用制备的抗体进行免疫组织化学染色,ARIP1在小鼠大脑组织主要表达在下丘脑及海马。结论:成功地制备了抗ARIP1多克隆抗体,该抗体可用于ARIP1成熟蛋白表达的免疫组织化学染色分析。

激活素受体相互作用蛋白在海马神经细胞中的表达及其作用

目的 在发现和克隆新的激活素受体相互作用蛋白 3(ActRIP3)基因的基础上 ,探讨ActRIP3在海马神经细胞介导激活素信号传导的作用。方法 利用GST- ActRIP3融合蛋白免疫家兔制备抗ActRIP3抗体 ,采用RT -PCR及免疫组化染色分析ActRIP3在脑组织中的表达与分布 ,采用pcDNA-ActRIP3与CAGA -lux质粒共转染海马神经细胞 ,分析信号传导作用。结果RT- PCR及免疫组化染色显示ActRIP3在海马神经细胞中高表达 ,构建的pcDNA- ActRIP3表达载体在体外培养海马神经细胞中可有效表达ActRIP3蛋白 ,过表达ActRIP3可促进激活素诱导的海马神经细胞特异信号传导。结论 ActRIP3具有促进激活素信号传导作用 ,是介导激活素作用于海马神经细胞的关键性信号传导蛋白。

激活素受体相互作用蛋白2在小鼠Hepa1-6细胞中的表达及调控

目的研究激活素受体相互作用蛋白2(ARIP2)在小鼠肝细胞中的表达及调控。方法采用半定量PCR技术检测ARIP2 mRNA在Hepal-6细胞中转录水平的动力学变化规律及其调控因素。结果Activin A刺激Hepal-6细胞ARIP2 mRNA的转录水平呈时间依赖性升高,刺激早期(4h)无明显变化,12h后显著升高。信号传导激动剂PMA和LPS刺激He- pal-6细胞24h,均可上调ARIP2 mRNA的转录水平,而A23187则抑制其转录。ARIP2过表达明显抑制Hepal-6细胞ActRIIA mRNA的转录水平,对ActRIIB则无影响。结论ARIP2作为激活素信号传导抑制蛋白,其表达受多种因素影响。ARIP2可能通过影响ActRIIA表达,参与激活素作用后期的信号传导负反馈调节过程。

激活素受体相互作用蛋白4的基因克隆

目的:克隆新的与激活素受体ⅡA(ActRⅡA)相互作用蛋白,即激活素受体相互作用蛋白4(ActRIP4)基因。方法:应用ActRIP2基因片段作为探针,从小鼠cDNA文库中钓取ActRIP4 cDNA;采用哺乳细胞双杂交进一步确定ActRIP4与ActRⅡA的相互作用;RT-PCR检测ActRIP4 mRNA在组织中的表达情况。结果:克隆的ActRIP4基因全长691bp,ORF区编码118个氨基酸残基;ActRIP4与ActRⅡA具有特异性结合作用;天然的ActRIP4 mRNA在小鼠多种组织中表达。结论:ActRIP4属于ActRIP家族新成员,可以与ActRⅡA相互作用,可能在多种组织中介导激活素受体信号传导过程。

激活素受体相互作用蛋白2a的全长基因克隆及其与ActRIIA的相互作用

为了研究激活素受体介导的信号传导调控机制,从小鼠脑cDNA文库中克隆了新的激活素受体相互作用蛋白2a(ARIP2a)全长基因;并通过序列分析与已发现的ARIP2进行了同源性比较;用RT-PCR方法检测了小鼠ARIP2a及ARIP2 mRNA的组织分布以及激活素刺激RAW264．7细胞后ARIP2a及ARIP2 mRNA表达的差异;同时应用哺乳细胞双杂交、Pull-down实验分析了ARIP2a和激活素IIA型受体(ActRIIA)的相互作用．结果表明,克隆的ARIP2a基因全长1008bp,编码153个氨基酸残基,与ARIP2编码蛋白仅第99位氨基酸不同;ARIP2a mRNA在大脑、垂体、睾丸中表达较高,胰腺、卵巢组织中表达较弱,而在其他组织中未见表达;ARIP2 mRNA则在多种组织内均有表达．激活素刺激RAW264．7细胞后ARIP2a mRNA表达明显降低,而ARIP2 mRNA表达升高．哺乳细胞双杂交和Pull—down实验均证实ARIP2a可与ActR II A相互作用．上述结果提示ARIP2a与ARIP2在组织学分布以及对激活素应答上均存在差异,两者属于ARIP2同源分子．ARIP2a属于ARIP家族新成员,同样可与激活素Ⅱ型受体相互作用．

激活素受体相互作用蛋白ARIPzip真核表达载体的构建及表达

目的构建激活素受体相互作用蛋白(activin receptor interacting protein zip,ARIPzip)真核表达载体,以便进一步探讨其生物学作用。方法从小鼠成纤维细胞3T3中提取RNA,并利用ARIPzip特异性引物通过RT-PCR方法扩增了ARIPzip cDNA,并克隆入pcDNA-Flag载体中,构建重组载体pcDNA-F-ARIPzip。将重组载体转染入HEK293细胞中,并通过免疫印迹方法检测ARIPzip的表达。结果酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;免疫印迹结果显示,瞬时转染重组质粒的HEK293细胞中可有效表达ARIPzip。结论本研究成功构建了激活素受体相互作用蛋白ARIPzip真核表达载体,并能够在真核细胞中进行表达,为进一步研究ARIPzip的生物学功能奠定了基础。

跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子对系统性红斑狼疮作用的研究进展

跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(TACI)对B淋巴细胞的稳态和自身免疫起负调控作用。敲除TACI基因的小鼠出现狼疮样自身免疫性疾病,同时TACI-Fc可影响B细胞的增生和存活,抑制抗体的产生,现已作为一种生物制剂用于治疗SLE,所以对TACI的研究及其在临床上的应用越来越受关注。本文就目前对TACI生物学作用及其应用于SLE的治疗研究进行综述。

补体C5a通过p38丝裂素活化蛋白激酶途径激活单核细胞

最近美国学者对多器官功能障碍综合征（MODS）发病时C5a如何激活单核细胞（PBWCs）引起炎症失控的机制进行了研究。他们从健康志愿者外周血中分离PBWCs，用C5a（100μg／L）预处理1h，然后用脂多糖（LPS）10μg／L刺激20h。由于C5a可能通过3种丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）途径激活PBWCs，所以在加入C5a前1h加入3种促MAPK抑制剂，

ActRIPs在激活素受体信号传导中的作用

激活素属于TGF-β超家族成员的多功能因子,其受体属于TGF-β超家族的Ser/THr激酶型受体,由Ⅰ型和Ⅱ型组成,Ⅱ型受体与配体激活素特异结合,再激活Ⅰ型受体,进一步通过Smad蛋白家族的级联反应将信号传入胞核。最新的研究发现Ser/THr激酶型受体介导的信号传导实际上受控于Ⅱ型受体,细胞内激活素受体相互作用蛋白(ActRIPs)参与了Ⅱ型受体的活性调控,ActRIPs蛋白家族具有与激活素Ⅱ型A受体(ActRⅡA)C末端特异结合的活性,不同的ActRIPs具有不同的作用,Ac-tRIP1以脚手架形式与ActRⅡA及Smad3结合,抑制细胞内Smad途径信号传导;ActRIP2与ActRⅡA结合后,通过其C末端介导受体内吞作用,对信号传导也具有抑制作用;ActRIP3则与ActRIP1,2不同,其与ActRⅡA结合后,具有促进信号传导的作用。ActRIPs的发现,使人们更清晰地认识到Ser/THr激酶型受体介导的信号传导调控机制。

激活素受体相互作用蛋白1及2在小鼠巨噬细胞中的表达

目的探讨激活素受体相互作用蛋白(Activin receptor-interacting protein,ARIP)1及2(ARIP1,2)在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及作用。方法采用免疫细胞化学染色法检测RAW264.7细胞中ARIP1,2的表达;将质粒CAGA-lux、CMV-gal分别与表达质粒pcDNA3-ARIP1、pcDNA3-ARIP2或空质粒pcDNA3共转染RAW264.7细胞,应用激活素A刺激,检测细胞内报告基因转录荧光素酶的活性;实时定量RT-PCR检测ActRⅡA mRNA的表达。结果免疫细胞化学染色结果显示,小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞表达ARIP1,2;RAW264.7细胞过表达ARIP1,2均能抑制Activin A诱导的特异基因转录;过表达ARIP2可抑制RAW264.7细胞ActRⅡA mRNA的表达,而过表达ARIP1对ActRⅡA mRNA的表达无明显影响。结论 ARIP1,2在小鼠巨噬细胞中共表达,并具有下调激活素信号传导的作用,但其作用方式不同。

ARIP2蛋白在小鼠肝细胞中的表达及其生物学作用

目的:探讨激活素受体相互作用蛋白2(ARIP2)在肝细胞内的表达形式及其介导的生物学作用.方法:采用免疫组织化学及细胞化学染色、Western blot检测ARIP2蛋白在小鼠肝组织及肝癌细胞系Hepal-6细胞内的表达;采用激活素特异应答的CAGA-lux报告基因质粒分析ARIP2对激活素诱导的特异基因转录的影响;MTT法检测ARIP2过表达对Hepal-6细胞增殖的彰响.结果:ARIP2蛋白可在小鼠肝组织及Hepal-6细胞表达.激活素A刺激Hepal-6细胞ARIP2蛋白表达呈时间依赖性升高,于24 h达到高峰;12 h、24 h测定值与对照组相比有显著性意义(1.01±0.16,1.62±0.26 vs 0.82±0.11.P<0.05).pcDNA3-ARIP2转染Hepal-6细胞.可以明显抑制激活素诱导的特异基因转录;MTT检测显示激活素A(5μg/L、10μg/L)可以明显抑制Hepal-6细胞增殖,其570 nm吸光度值与对照组相比有显著差异(1.59±0.03、1.49±0.04 vs 1.79±0.07,P<0.05,P<0.01).在Hepal-6细胞内过表达ARIP2可以阻断激活素A对Hepal-6细胞的增殖抑制作用.结论:ARIP2有望成为治疗激活素诱导的肝脏损伤性疾病的基因调控靶点.

激活素受体相互作用蛋白1,2在小鼠脑神经细胞中的共表达

目的探讨激活素受体相互作用蛋白1(activin receptor-interaction protein 1,ARIP1)和ARIP2在小鼠脑神经细胞中的共表达。方法 RT-PCR法检测C57BL小鼠小脑、垂体、大脑、脾脏、心脏、肾脏、肝脏、胰腺组织中ARIP1和ARIP2基因mRNA的转录;以融合蛋白GST-ARIP1C和MBP-ARIP2C作为抗原免疫新西兰白兔,制备抗ARIP1和ARIP2抗体,经A蛋白亲和层析柱纯化后,ELISA法检测抗体的交叉反应;用制备的抗体,采用免疫组织化学染色检测ARIP1和ARIP2在小鼠脑组织中的表达;RT-PCR法检测小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞中激活素ⅡA型受体(activin receptorⅡA,ActRⅡA)、ARIP1和ARIP2基因mRNA的转录。结果在小鼠大脑、小脑及垂体组织中可见ARIP1基因mRNA的转录,在小鼠各部位组织中均可见ARIP2基因mRNA的转录;制备的兔抗ARIP1和ARIP2抗体无交叉反应;ARIP1和ARIP2在小鼠脑组织的海马和下丘脑同时表达;ActRIⅡA及ARIP1和ARIP2 mRNA在神经元样细胞系Neuro-2a细胞中共表达。结论 ARIP1和ARIP2可在小鼠脑神经细胞中共表达。

5′-氮杂-2′-脱氧胞苷对人肺鳞状细胞癌细胞株NCI-H226和NCI-H520中CNRIP1基因甲基化及蛋白表达的影响

目的探讨5′-氮杂-2′-脱氧胞苷对人肺鳞状细胞癌细胞株NCI-H226和NCI-H520中大麻素受体相互作用蛋白-1(CNRIP1)基因甲基化和蛋白表达的影响。方法取对数生长期NCI-H226和NCI-H520细胞株分为实验组和对照组,对照组细胞使用不含5′-氮杂-2′-脱氧胞苷的培养基继续培养;将实验组细胞分为0.5、1.0、1.5μmol·L^-1组,分别使用含不同浓度(0.5、1.0、1.5μmol·L^-1)5′-氮杂-2′-脱氧胞苷的培养基继续培养。取各组培养72 h后的细胞进行DNA提取及蛋白提取,采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测各组细胞中CNRIP1基因的甲基化状态,采用Western blot检测各组细胞中CNRIP1蛋白表达。结果对照组和0.5μmol·L^-1组NCI-H226、NCI-H520细胞株均显示为甲基化,1.0、1.5μmol·L^-1组中2种细胞株均显示为非甲基化。0.5、1.0、1.5μmol·L^-1组2种细胞株中CNRIP1蛋白表达量均高于对照组(P<0.05);0.5、1.0、1.5μmol·L^-1组2种细胞株中CNRIP1蛋白表达量随浓度的增加而升高,两两比较差异均有统计学意(P<0.05)。结论人肺鳞状细胞癌细胞株NCI-H226和NCI-H520中CNRIP1基因发生甲基化可能是导致基因表达下调甚至失活的主要原因,5′-氮杂-2′-脱氧胞苷可以逆转CNRIP1基因甲基化状态,促进CNRIPI蛋白表达。

5-脂氧合酶激活蛋白基因多态性与环境因素在缺血性卒中发生中的交互作用

目的探讨5-脂氧合酶激活蛋白基因（ALOX5AP基因）启动子区rs17222919位点基因多态性与环境因素在河南汉族人群缺血性卒中（Is）发病中的交互作用。方法对河南省汉族622例Is患者和631名健康对照者进行环境危险因素调查，运用TaqMan—PCR技术对ALOX5AP基因rs17222919位点进行基因分型，探讨其与IS发生的相关性，并根据交互作用系数（γ,γ=βeg/βe）判断交互作用及其作用模型。结果Is组rs17222919位点的TG（189／622，30．4％）、GG（18／622，2．9％）基因型频率及G等位基因频率（225／1244，18．1％）显著低于健康对照组（221／631，35．0％；31／631，4．9％；283／1262，22．4％），差异具有统计学意义（X2=4．117，P=0．042；x2=4．457，P=0．035；x2=7．294，P=0．007）。TG＋GG基因型与高血压、糖尿病、吸烟之间在Is发病中均存在负向交互作用（y=0．943、0．922、0．830），其作用模型均为超相乘模型。结论IS的发生是遗传及环境因素相互作用的结果。在河南汉族人群中，rs17222919位点G等位基因可能对Is发病的环境危险因素高血压、糖尿病、吸烟暴露的效应具有减弱作用。

ATF5与TCF4相互作用及其对Wnt信号通路的调控

应用酵母双杂交技术, 鉴定Wnt通路关键信号分子TCF4与cAMP效应元件结合蛋白家族新成员-- 激活转录因子5(ATF5)之间的相互作用, 酵母表型分析和β-半乳糖苷酶(β-gal)活性测定结果发现, 两者的作用位于ATF5蛋白C端含有碱性亮氨酸拉链(bZIP)区域(162～ 282 aa). 通过受TCF启动的荧光酶报告系统分析ATF5对Wnt信号通路的影响, 结果显示ATF5蛋白C端能进一步加强TCF4对Wnt通路的激活效应. 由此提示, ATF5可能是Wnt通路下游信号的辅助激活因子(co-activator), 它能协同β-连环蛋白/TCF4参与Wnt信号通路的激活.

ARIP1,2 mRNA及其蛋白在小鼠脑组织表达和分布的比较研究

目的比较新发现的激活素受体相互作用蛋白1,2(ARIP1,2)在小鼠脑组织的表达与分布。方法采用Northern杂交检测ARIP1,2 mRNA,Western杂交及免疫组化染色检测ARIP1,2蛋白。结果Northern杂交显示ARIP1,2 mRNA在小鼠组织中的表达形式明显不同,ARIP1主要在脑组织表达,ARIP2组织表达广泛。Western杂交进一步揭示ARIP1在大脑、小脑、海马、下丘脑及垂体表达,而ARIP2在大脑、小脑、海马、下丘脑、垂体及脾脏均有不同程度表达。免疫组化染色显示,ARIP1,2成熟蛋白在大脑、小脑及垂体均有表达,ARIP1在大脑和小脑皮质主要表达在小细胞神经元,而ARIP2主要表达在大细胞神经元。ARIP1在神经垂体和腺垂体表达水平明显高于ARIP2。结论ARIP1,2均表达于脑和垂体,但其表达的细胞类型和强度明显不同,这种差异可能与其在神经细胞中介导激活素生物学活性差异有关。

益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面TGF-β/ALK5/Smad2/3通路的影响

目的 :探讨益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面转化生长因子-β(TGF-β)/激活素受体样激酶(ALK)5/Smad蛋白2/3通路的影响。方法 :将50只大鼠随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、糖尿病对照组、正常对照组。通过腹腔注射链脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型,运用Westernblot技术手段分别检测各组肉芽增生期创面成纤维细胞ALK5/Smad2/3的表达水平。结果:糖尿病对照组ALK5表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组ALK5表达水平明显低于糖尿病对照组(P<0.05),其与益气组、化瘀组、正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。糖尿病对照组smad2表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组smad2表达水平与各组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病对照组smad3表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组smad3表达水平低于化瘀组(P<0.05),明显低于糖尿病对照组、益气组(P<0.01),高于正常对照组(P<0.05)。结论:糖尿病创面难以愈合及瘢痕形成的机制可能与ALK5/Smad2/3通路有关,益气化瘀中药可能通过抑制ALK5/Smad2/3通路,加速创面愈合,减少瘢痕形成。