黄牛肉中钙激活酶系统的动力学性质

【目的】阐明牛肉中钙激活酶系统的主要动力学特征。【方法】通过温度、时间、Ca2+浓度、反应时间、酶量、底物浓度等的变化,分析μ-钙激活酶,m-钙激活酶和钙激活酶抑制蛋白的动力学特性。【结果】随冷冻温度的升高和贮存时间的延长,钙激活酶系统活性都逐步降低,但冷冻处理可以显著降低钙激活酶抑制蛋白的活性,而钙激活酶对冷冻处理不太敏感;μ-钙激活酶达到最大活性一半时所需的Ca2+浓度为50μmol·L-1,m-钙激活酶为320μmol·L-1;在测定钙激活酶活性时,反应时间应控制在60min以内,酶活单位应小于0.45;在以酪蛋白为底物时,m-钙激活酶的Km值为3.185mg·mL-1,Vmax为0.015U·min-1,而μ-钙激活酶的Km值为5.320mg·mL-1,Vmax为0.017U·min-1。【结论】钙激活酶系统活性受贮藏温度和时间、Ca2+浓度、酶促反应时间、酶量、底物浓度影响明显。

泛素激活酶抑制剂对猪精子获能状态、膜重构及体外受精的影响

【目的】评估泛素激活酶(E1)对猪精子获能、膜重构和体外受精的影响。【方法】选取5头长白猪采集精液,以硫醇酯法评估泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme, E1)抑制剂(TAK-243)对精子中泛素(ubiquitin, Ub)与E1结合的影响;将精子分为鲜精组(Fresh)、DMSO组(DMSO)、获能组(Capacitated)及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组,鲜精组用2 mL PBS重悬精子沉淀;获能组用2 mL获能液重悬精子沉淀;DMSO组及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组分别用2 mL含0.07%DMSO及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243的获能液重悬精子沉淀,使用微生物动(静)态图像检测系统检测精子的动力学参数;以Western blotting法检测精子的酪氨酸磷酸化水平;Zn2+荧光探针检测精子的Zn2+含量;花生凝集素染色检测精子的顶体膜重构;免疫荧光法检测顶体表面精子黏附蛋白(AQN-1、AWN)的表达;体外受精法检测TAK-243对精卵结合和卵裂率的影响。【结果】硫醇酯分析结果表明,TAK-243处理组精子未形成Ub-E1复合物,说明TAK-243抑制了E1对Ub的激活作用。与鲜精组相比,获能组精子的曲线速度(VCL)和平均鞭打频率显著升高(P<0.05)。3个浓度TAK-243组与获能组精子的各项动力学参数差异均不显著(P>0.05)。与获能组相比,3个浓度TAK-243组酪氨酸磷酸化水平均显著降低(P<0.05),且随着TAK-243浓度的增加,精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平逐渐降低。后续试验使用7.2 nmol/L TAK-243进行精子中Zn2+水平和顶体膜重构的研究,其结果表明,与获能组相比,7.2 nmol/L TAK-243组Zn2+水平、顶体膜完整性及AQN-1和AWN蛋白的表达水平均显著增加(P<0.05),精子与卵母细胞的黏附率和卵裂率均显著降低(P<0.05)。【结论】7.2 nmol/L TAK-243显著降低了精子获能期间蛋白酪氨酸磷酸化水平、精卵结合率和卵裂率,显著增加了Zn2+含量、顶体膜完整率及顶体表面蛋白AWN和AQN-1的表达,说明泛素-蛋白酶体信号通路参与了精子的体外获能。

m-钙激活酶的分离纯化方法研究

本试验对牛脾脏中的m-钙激活酶进行了分离纯化,以便进一步研究其动力学特性和在牛肉成熟中的作用。对宰后30min牛肉匀浆后利用超高速冷冻离心、离子交换层析、疏水层析等技术,从中分离纯化出了m-钙激活酶,测得其比活力为39.7U/mg。利用变性电泳对纯化后的样品进行了验证。

钙激活酶的高压反应动力学研究

通过对真空包装的牛肉施加不同的压力 (10 0 Mpa～ 35 0 Mpa)和不同时间的处理 ,分析测定牛肉中钙激活酶和钙激活酶抑制蛋白活性的变化规律 ,研究了钙激活酶及其抑制蛋白的压力动力学 ,并探讨了高压嫩化牛肉的作用机理。结果表明钙激活酶对压力有一定的耐受性 ,而钙激活酶抑制蛋白对压力较敏感。

动物宰后钙激活酶系统的作用机制

从肌肉到食用肉的转化是一个复杂的过程,它导致尸体肌肉中的一系列状态大大不同于它们在活体中的状态。动物死后肌肉的嫩化与肌原纤维蛋白降解有关。钙激活酶和其内在的抑制物钙激活酶抑制蛋白是引起肌原纤维蛋白降解的主要因素。

微生物激活酶在煤低温干馏废水生化处理系统调试中的试验研究

甘肃宏汇能源化工有限公司煤低温干馏废水成份复杂、污染物浓度高、生物毒性大、处理难度大,如何快速调试启动废水生化处理系统达到设计能力,已经成为制约煤低温干馏生产主装置投产的重要因素之一。通过采用微生物激活酶技术结合活性污泥,快速激活微生物菌群,在15天内调试启动了生化系统,达到了设计处理能力,出水可以达到GB16171-2012直接排放标准的要求进行稳定排放。

钙激活酶激活蛋白的研究进展

钙激活酶 (calpain)是促进宰后肌肉嫩化的主要的内源酶。钙激活酶激活蛋白 (calpainactivator)是钙激活酶系统的成员之一 ,是区别于钙激活酶抑制蛋白 (calpastatin)的钙激活酶的正调节蛋白。目前已对其激活特性、氨基酸序列及cDNA序列实行了研究 ;但其结构和激活机理还不清楚。

钙离子和钙激活酶外源抑制剂对牛肉钙激活酶活性和超微结构的影响

3头改良黄牛 (鲁西黄牛×犁木赞 )在屠宰厂按照标准的屠宰工艺屠宰并预冷 2 0h后取样 ,样品分 7组 ,按样品重 10 %分别注射蒸馏水 (对照 )、 2 0 0mmol·L-1CaCl2 、 2 0 0mmol·L-1EGTA、 2 0 0mmol·L-1ZnCl2 、 0 2mg·mL-1亮抑蛋白酶肽、 0 2mg·mL-1亮抑蛋白酶肽 +0 0 1mg·mL-1TritonX 10 0、 0 0 1mg·mL-1TritonX 10 0 7个不同处理 ,将样品分别成熟 3、8和 16d后测 μ 钙激活酶 (μ calpain)和m 钙激活酶 (m calpain)的活性并观察肌纤维超微结构。实验结果发现 ,与注射CaCl2 的牛肉相比 ,注射外源性钙激活酶抑制剂 (亮抑蛋白酶肽、ZnCl2 )牛肉的 μ 钙激活酶保持活性时间延长 ,超微结构变化受到抑制。提示 ,钙激活酶特别是 μ 钙激活酶很可能参与了牛肉嫩化过程并发挥着关键作用。

牛脾脏中μ-钙激活酶的分离纯化方法研究

本试验旨在通过采用多种生物学分离手段和多个分离步骤从牛脾脏中分离纯化μ-钙激活酶。对宰后30min黄牛脾脏通过匀浆后利用超高速冷冻离心、离子交换层析、疏水层析、分子筛等技术,从中分离纯化出了μ-钙激活酶,最后得到的μ-钙激活酶的比活力为38.4U/mg。并对分离纯化过程中各主要步骤μ-钙激活酶的总活性、比活力等参数变化进行了测定,同时采用不连续十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和活性电泳(caseinzymography)对纯化过程中的样品进行了鉴定。

体外氧化μ-钙激活酶对牛肉肌原纤维蛋白降解的影响

在体外,将μ-钙激活酶用不同浓度的氧化剂(0μmol·L-1H2O2+0μmol·L-1Fe2+、300μmol·L-1H2O2+600μmol·L-1 Fe2+、400μmol·L-1 H2O2+800μmol·L-1 Fe2+、500μmol·L-1 H2O2+1 000μmol·L-1 Fe2+)氧化,并用其孵育分离纯化的牛肉肌原纤维蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting分析氧化的μ-钙激活酶对肌原纤维蛋白降解的影响。结果表明:随着氧化剂浓度的升高,μ-钙激活酶降解肌间线蛋白和肌钙蛋白T的能力减弱,同时相对分子质量为30×103肌钙蛋白T降解的产物减少。表明,μ-钙激活酶的氧化抑制其对部分肌原纤维蛋白的降解。

鸡肉钙激活酶与其它畜禽肉中钙激活酶对钙离子浓度敏感性的比较

【目的】研究鸡肉中钙激活酶的种类和性质,并与其它畜禽肉以及鱼肉中钙激活酶对钙离子浓度敏感性进行比较。【方法】提取宰后0 d鸡胸肉中的钙激活酶,通过硫酸铵沉淀和透析的方法对鸡肉钙激活酶进行纯化,采用活性电泳的方法检测钙激活酶种类和活性。通过设置0、0.01、0.03、0.05、0.10、0.50和5.00 mmol.L-1的钙离子浓度,比较鸡肉、鱼肉、鸭肉、兔肉、猪肉、牛肉在宰后0 d肉样中不同种类的钙激活酶对钙离子的敏感性。【结果】禽肉鸡肉、鸭肉中μ-钙激活酶的电泳迁移率小于哺乳类兔肉、猪肉、牛肉,当Ca2+浓度从0.01 mmol.L-1升到0.03 mmol.L-1时,兔肉、猪肉和牛肉μ-钙激活酶活性增加,但鸡肉和鸭肉钙激活酶活性没有改变(P>0.05),说明禽类μ-钙激活酶对钙离子的敏感程度高于哺乳类;在禽类鸡肉、鸭肉中存在另外一种钙激活酶,其对钙离子的敏感性介于哺乳动物中的m-钙激活酶和μ-钙激活酶之间,并且它在禽肉中的活性分别占67.4%和88.4%。【结论】鸡肉中的钙激活酶对钙离子浓度敏感性高于哺乳类。

牛肉成熟过程中氧化对钙激活酶活性及降解的影响

为了探究牛肉宰后成熟过程中氧化对钙激活酶活性及降解的影响,在牛屠宰后立即取其背最长肌,注射不同浓度氧化剂(0 mmol/L H2O2+5 mmol/L NaCl;50 mmol/L H2O2+5 mmol/L NaCl;200 mmol/L H2O2+5 mmol/L NaCl;500 mmol/LH2O2+5 mmol/L NaCl)。真空包装后于4℃成熟。分别在0、1、3、7、14 d时取样,通过活性电泳和蛋白免疫印迹进行分析钙激活酶的活性和降解情况。结果表明:在牛肉的宰后成熟过程中,随着氧化程度的提高,μ-钙激活酶活性逐渐减弱,降解程度逐渐增强,而m-钙激活酶活性几乎未发生变化。因此,氧化促进了μ-钙激活酶的降解并抑制了其活性。

钙激活酶激活蛋白基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建钙激活酶激活蛋白基因(UK114)的原核表达载体并优化其表达条件,为其高效表达提供试验依据。以UK114 cDNA为模板,通过PCR方法扩增钙激活酶激活蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、菌体浓度、培养温度等来优化表达条件。结果显示,原核表达载体pGEX-4T-3-UK114成功构建,可在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约40 kD的GST-UK114融合蛋白。在IPTG浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为32℃,诱导时间为4 h,菌体密度OD600为0.6的条件下,目的蛋白表达量最高。试验成功构建原核表达载体pGEX-4T-3-UK114且获高效表达,为研究UK114生物学活性及产品开发提供了试验基础。

甘油脱水酶再激活酶的克隆表达及活性鉴定

运用PCR技术从克雷伯氏菌的基因组中分别扩增得到了编码甘油脱水酶再激活酶α、β两个亚基的基因gdrA、gdrB。将gdrA、gdrB克隆至pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-gdrAB。经测序正确后,将gdrAB亚克隆至表达载体pET-28a(+)上构建表达质粒pET-28gdrAB。利用双抗生素筛选法,将pET-28gdrAB与连有甘油脱水酶基因的表达载体pET-32gldABC在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中共表达,鉴定了甘油脱水酶再激活酶的活性。

宰后牦牛肉成熟过程中钙激活酶与嫩度指标的相关性分析

以10头甘南牦牛为研究对象,对宰后8d成熟期间肌原纤维小片化指数、剪切力、肌纤维直径、μ-钙蛋白酶(μ-calpain)、m-钙蛋白酶(m-calpain)、钙蛋白酶抑素(calpastatin)的活力进行了测定,同时研究了3种酶活力与肌原纤维小片化指数、剪切力、肌纤维直径3个嫩度指标之间的相关性。结果表明:μ-calpain、m-calpain、calpastatin3种酶与剪切力值及肌纤维直径均呈正相关;3种酶与肌原纤维小片化指数呈负相关,其中μ-calpain与calpastatin呈显著负相关(P<0.05)。因此,钙激活酶活力的变化可能导致了肌原纤维小片化指数的增加,肌原纤维的弱化和肉的嫩化,μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要贡献者。

人直肠腺癌血管内皮细胞局部粘附激活酶的表达

癌细胞发生血管转移 ,首先涉及癌细胞与血管内皮细胞的相互作用。关于血管内皮细胞与肿瘤细胞相互作用的分子机制 ,国外一些学者采用体外培养血管内皮细胞进行研究 ,发现与一些粘附分子有关 ,但作用途径尚不清楚。研究采用直肠癌病人癌周直肠组织和癌转移淋巴结 ,研究癌浸润转移的血管内皮细胞的胞内信号传导激活途径 ,为探讨恶性肿瘤血管浸润转移机理提供理论资料。信号传递通路中令人瞩目的是 pp12 5FAK,它与 Vinculin,talin等一起分布于细胞粘附斑外 ,分子量 12 5KD,故称为局部粘附激活酶 ( focal adhesion kinase pp12 5FAK)。应用冰冻切片免疫组织化学法 ,结果发现癌细胞发生血管转移时 ,血管内皮细胞 pp12 5FAK呈阳性 ,免疫反应产物位于内皮细胞胞质内 ,说明癌细胞的血管转移与血管内皮细胞 pp12

PCR法扩增钙激活酶激活蛋白cDNA

钙激活酶激活蛋白是钙激活酶的激活蛋白, 可以促进钙激活酶活性的发挥, 从而促进肉的嫩化。采用PCR技术, 以山羊肝脏cDNA为模板经扩增得到钙激活酶激活蛋白(calpainactivator) 基因, 并进行了序列测定。该片段长1 017bp, 5′—端非翻译区长39bp, 3′—端非翻译区长567bp。编码区长411bp, 编码一个长137个氨基酸残基的蛋白质, 其理论分子量为14 298Da。与EdonMelloni等(1998) 报道的从牛脑中提取纯化的钙激活酶激活蛋白的氨基酸序列相比发现, 二者仅有五个位点不同。

肠癌淋巴管内皮细胞局部粘附激活酶的表达

为研究淋巴管内皮细胞与肿瘤细胞相互作用的分子机理，探讨癌浸润转移的淋巴管内皮细胞的胞内信号传导激活途径，用冰冻切片免疫组化法对８ 例直肠腺癌患者的癌周直肠组织和癌周淋巴结进行了检查。结果发现，癌细胞发生淋巴管转移时，淋巴管内皮细胞ｐｐ１２５ＦＡＫ 阳性，免疫反应产物位于内皮细胞胞质内。说明癌细胞的淋巴管转移与淋巴管内皮细胞ｐｐ１２５ＦＡＫ

离子交换色谱法对肌肉中钙激活酶分离纯化的研究

试验通过离子交换色谱法对肌肉中钙激活酶(Calpain)进行定量分析研究,确定了Calpain粗提液制备工艺。对Calpain粗提液进行全波长紫外扫描说明276～280nm处有一个吸收高峰。应用DEAE离子交换层析对Calpain进行纯化,用0～500mmol·L-1NaClTris-HCl进行离子强度线性梯度洗脱,在280nm波长下测定洗脱液的光吸收值,洗脱得3个蛋白峰,μ-Calpain和m-Calpain分别在NaCl为130～180mmol·L-1和260～300mmol·L-1时洗脱下来,钙激活酶抑制蛋白(Calpastatin)在NaCl为70～110mmol·L-1时洗脱下来。Calpain分子量为110000u,通过电泳试验表明,本检测结果提取液正好在分子量约为110000u处有一条清晰的带,说明所得提取物为Cal-pain,而且纯度较高。

钙激活酶激活蛋白cDNA的克隆与序列分析

钙激活蛋白酶(calpain)是动物宰后导致肉嫩化的主要蛋白酶。促进calpain活性的发挥,从而提高肉的嫩度,一直是肉类科学研究工作者的重要研究课题。最新的研究表明,钙激活酶激活蛋白(calpainactivator)———钙激活蛋白酶(calpain)系统的一个新成员,是calpain活性的主要调节者。Calpainactivator可以激活calpain,使其活性提高大约400倍。利用分子生物学方法克隆calpainactivator,为生物肉嫩化技术奠定基础,是食品领域应用生物技术提高生产效率的又一新的课题。本文利用PCR方法克隆了calpainactivatorcDNA序列,并对其进行了序列分析。结果表明,该片段长1017bp,5'—端非翻译区长39bp,3'—端非翻译区长567bp。编码区长411bp,编码一个长137个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子量为14298Da。与EdonMelloniet.al1998年报道的从牛脑中提取纯化的钙激活酶激活蛋白的氨基酸序列相比发现,二者仅有五个位点不同。