激流灌注式生物反应器培养猪瘟活疫苗工艺的研究

为建立规模化培养猪瘟活疫苗的生产工艺,本研究利用工作体积为10L的激流灌注式生物反应器培养猪睾丸细胞（swine testis,ST）,接种猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）进行培养研究。研究结果显示,培养4 d细胞数可增长5~7倍,接种病毒后15 d可收获毒液6次,收获量至少与200个10 L转瓶单次收获量相当,产品各项检测均合格。本工艺极大地缩短了培养时间,为规模化培养工艺的推广与使用提供了技术参数。

PRRSV-R98在激流灌注式生物反应器内增殖水平的研究

为了建立激流灌注式生物反应器规模化生产猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产工艺,本研究以AP20C型生物反应器为生产工具对猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株（PRRSV-R98）的增殖水平进行了研究。结果显示,应用激流灌注式生物反应器生产猪繁殖与呼吸综合征病毒96h达到最佳接毒时间,接种后36~39h收获病毒液,效价较转瓶提高十倍以上。

激流式生物反应器培养MDCK细胞条件优化

应用激流式生物反应器培养MDCK细胞,从培养基种类、接种密度、pH和溶氧量等关键参数进行优化。结果表明,激流式生物反应器培养MDCK细胞,细胞接种密度为1.5×106个/mL、pH7.2、溶氧量50%～60%、循环流量400mL/min和振荡频率60r/min条件下培养5d可达到最大细胞密度(1.02×107个/mL)及最高糖耗量(3.1g/L),为激流生物反应器大规模培养细胞及病毒疫苗生产奠定基础。

激流式生物反应器温度控制中PID控制算法的改进研究

目的:改进常规比例-积分-微分(proportion-integration-differentiation,PID)控制容易产生积分饱和的情况,设计一种适合激流式生物反应器的温度控制策略。方法:根据激流式生物反应器对温度控制的要求,通过实验确定温度控制系统模型,再利用仿真实验验证积分限幅PID控制的有效性,最后结合实际实验结果利用积分分离法进一步改进积分限幅PID控制并验证其有效性。结果:通过仿真实验可知积分限幅PID控制效果较好,但实际实验结果仍存在较大超调量及稳定时间长的问题,利用积分分离法对积分限幅PID进行改进后得到了良好的实验结果。结论:改进的积分限幅型PID控制方法可以有效避免因积分饱和造成的系统超调,并且能够达到较高的控制精度,说明改进的积分限幅型PID控制对激流式生物反应器温度具有很好的控制调节性能,能够很好地满足其培养动物细胞的要求。

应用激流式生物反应器大规模悬浮培养昆虫细胞(sf9)的工艺研究

应用激流式生物反应器对大规模悬浮培养sf 9细胞的工艺进行了研究,通过摸索细胞接种密度、溶解氧（DO）、反应器转速3项工艺参数,成功实现了sf 9细胞的大规模悬浮培养,细胞密度最高可达到0.8~1.5×106/ml,生长状态良好。

激流—灌注式反应器大规模培养Vero细胞工艺研究

反应器培养Vero细胞以微载体(Cytodex等载体)及NBS公司CellGen310酯片培养为主,培养工艺对设备、技术要求高,一次性投资大,微载体和酯片处理繁琐,耗材价格昂贵,生产成本高。实验采用一次性激流-灌注式生物反应器大规模培养Vero细胞,通过控制DO、pH等条件,开发出便捷、稳定的大规模培养工艺,为疫苗工业采用大规模细胞培养工艺生产疫苗奠定基础。

激流式生物反应器制备猪瘟高效细胞苗

在应用激流式生物反应器培养猪瘟病毒(CSFV)试验中,通过提升单位体积的细胞数量可以有效地提升抗原的效价。二种工艺从单位体积细胞数上比较,转瓶培养细胞数可达到2.5×10~5个/mL,反应器是1.5×10~6个/mL,反应器培养的细胞数是转瓶的6倍;从病毒滴度方面相比,转瓶制备的猪瘟抗原效价最高可达到40万RID/mL,反应器可达到60万RID/mL,反应器比转瓶培养的抗原效价提升50%。

基于准静态平面流场的新型皮肤组织工程灌注式生物反应室设计与初步模拟

目的设计准静态平面流场的灌注式新型生物反应器,以适合组织工程皮肤的培养要求。方法采用计算流体动力学(computational fluid dynamics,CFD)商业软件FLUENT模拟新型生物反应器中的流场及培养支架壁面上的切应力,设计出一种能够层叠、低剪切力、均匀平面流场的生物反应器。结果模拟结果表明筛网状支撑物及组织工程皮肤构建物表面处的最大切应力小于3×10-5N/cm2,且培养室中的流场是均匀的。结论新型生物反应器满足准静态平面流场的要求,有可能在未来的皮肤组织工程研究和生产中广泛使用。

应用一次性生物反应器大规模培养BHK-21细胞

采用20mL、220mL、10L、100L一次性激流&灌注式生物反应器连续灌注培养BHK-21细胞,通过控制pH、DO等工艺参数,得到稳定的培养BHK-21细胞的大规模培养工艺。从20mL、200mL、10L到100L实现了细胞数的逐级放大,认为该工艺为细胞反应器大规模生产动物疫苗奠定了技术基础。

利用新型一次性激流灌注式生物反应器培养动物细胞

利用新型一次性培养袋在5～10L激流灌注式生物反应器中培养3种贴壁和3种悬浮细胞,通过在线控制培养温度、pH值和溶氧等工艺参数,监测并分析培养过程中细胞密度、活率、糖耗等的变化情况.结果表明,贴壁培养细胞MDCK,VERO和DF-1培养6d后消化计数,密度分别达4.8×106,1.0×107和1.5×107mL-1,细胞状态良好,活率在90%以上.悬浮细胞CHO,BHK-21和Sf9经无血清悬浮驯化后,经种子链扩增,在激流式反应器中悬浮培养的初始接种密度分别为2.0×106,2.1×106和2.15×106mL-1时,培养一段时间后其最高培养密度分别可达2.0×107,2.1×107和1.8×107mL-1,维持培养时间分别为13,12和10d.

欧洲型PRRSV、PCV2重组痘病毒疫苗灌注式生物反应器培养工艺的建立

目的利用微载体-生物反应器技术培养乳仓鼠肾细胞,接种重组痘病毒rVTT-ORF2-EUO3O5,建立规模化制备欧洲型PRRSV、PCV2重组痘病毒疫苗的灌注式生产工艺。方法利用2L体积灌注式生物反应器培养BHK细胞,设定培养参数为温度37℃、溶氧度(DO)为60%,转速为80r/min,pH值为7.3。当90%微载体表面贴满BHK细胞时以0.1MOI的感染剂量接种重组痘病毒rVTT-ORF2-EUO3O5,设定感染参数为温度35℃、DO为50%、转速为50r/min,pH值为7.1,继续培养观察。结果在采用灌注式生物反应器技术制备重组痘病毒过程中的细胞培养阶段,细胞培养96h可获得1.587×1010个细胞数,细胞增殖39.67倍;在病毒增殖阶段,微载体上细胞完全脱落时的病毒滴度为2.12×109 PFU/ml。结论成功建立了欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒灌注式生产工艺,为规模化制备重组痘病毒疫苗提供了技术参数。

应用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞

目的采用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞。方法分别应用美国NBS公司的Celligen310型生物反应器和国产AP20SC型激流式生物反应器(单个细胞培养袋和4个细胞培养袋)连续灌流培养重组CHO细胞,连续培养35 d,每24 h收获1次,采用ELISA法测定细胞收获液中HBsAg的滴度。结果 Celligen 310型生物反应器培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续8 d,至第18天达最高水平(2.16μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.12μg/ml;国产AP20SC激流式生物反应器单个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续9 d,第18天达最高水平(2.20μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.08μg/ml,与Celligen 310型生物反应器相比,收液中HBsAg含量在2.0μg/ml水平持续时间无明显差异;国产AP20SC激流式生物反应器4个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续13 d,与该生物反应器单个细胞培养袋相比明显延长,第21天达最高水平(2.14μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.5μg/ml,明显高于单个细胞培养袋培养的细胞。结论国产AP20SC型激流式生物反应器可代替进口生物反应器对传代细胞进行大规模培养,用于人用疫苗的生产。

WAVE^(TM)生物反应器灌注培养生产种子细胞的开发和应用

近年来,国内中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)生产罐的培养规模已达上千升,国外已达上万升,最终的生产罐前需要多级摇瓶、种子罐进行种子细胞扩增,扩增效率较低,严重影响了抗体、融合蛋白等生物制品的生产效率。文中利用WAVETM波浪式生物反应器,通过灌注培养的方法,成功地实现了种子细胞的高效扩增。WAVETM波浪式生物反应器灌注培养方法制备种子细胞,CHO细胞密度高达2.28×107cells/mL时仍处于指数生长期且细胞活力大于95%,以此细胞作为种子细胞,4×105cells/mL接种于另一个WAVETM生物反应器进行流加培养,最大活细胞密度仍可达1.73×107cells/mL。通过此种扩增方式,1台WAVETM20/50即可为1 000 L或2 000 L的生产罐提供种子细胞,种子细胞的扩增倍数(Split ratio)可以达到1∶50～1∶100倍,与传统不锈钢罐种子细胞扩增倍数1∶2～1∶10相比,可以显著减少2～3级种子罐,种子细胞的扩增时间减少7～9 d,极大地提高生产效率。

纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗

为了用激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗,采用纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞,接种狂犬病病毒Flury株(LEP),测定病毒液滴度。将收获的病毒液制备兽用狂犬冻干活疫苗,按照狂犬病活疫苗规程进行检验。结果显示,3批收获的病毒液滴度平均达105.0LD50/0.03 mL;3批实验疫苗检验结果均符合质量标准。实验证明激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗提高了细胞密度、病毒滴度,增加了病毒液收获体积,减小了批间差,保证了产品均一性,适合工业化大生产。