雄激素受体剪接变异体7检测方法的研究进展

去势抵抗型前列腺癌(CRPC)治疗方法包括:以紫杉烷为基础的化疗、新型内分泌治疗、免疫疗法和镭233。目前尚无能预测CRPC患者治疗疗效并指导用药的临床生物标志物,大量研究显示雄激素受体剪接变异体(AR-V7)与阿比特龙、恩杂鲁胺耐药相关,而与紫杉烷类药物的耐药不相关,有望成为预测临床疗效、指导用药选择的一种临床实用的肿瘤标志物。然而,AR-V7的检测方法成为其应用于临床的挑战之一。本文就现有的AR-V7检测方法做一综述,并对AR-V7临床应用进行展望,以期推进AR-V7从实验室走向临床。

经鼻蝶窦行垂体瘤切除术后的激素变化及激素替代治疗疗效

目的:观察研究经鼻蝶窦行垂体瘤切除术后的激素变化以及应用激素替代治疗的临床治疗效果.方法:选择我院2015年3月~2018年3月收入的拟进行经鼻蝶窦实行垂体瘤切除术的垂体瘤患者100例,观察其术前术后相关激素水平,并在术后对患者进行腺体功能评估,根据需要对患者进行激素替代治疗,观察替代治疗后激素水平以及药物剂量的变化.结果:治疗后患者血清水GH、PRL平逐渐降低;FT4水平在术后次日有显著升高,替代治疗后逐渐降低直至恢复正常水平;TSH、ACTH、COR水平在术后次日显著降低,替代治疗后逐渐升高至正常水平;手术后,氢化可的松剂量随着时间的推移而逐渐降低,手术后3m左旋甲状腺素剂量显著低于手术后1d,手术后6m剂量升高;不良反应发生率为4%.讨论:经鼻蝶窦垂体瘤切除术可有效改善患者激素水平,配合术后长时间的激素替代治疗,可使患者相关激素水平逐渐恢复至正常.

Eur Urol:雄激素受体剪接变异体7预测激素敏感型前列腺癌患者雄激素剥夺疗法的短期应答

雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy,ADT)是初发转移性前列腺癌(prostate cancer,PCa)的基石性治疗,但绝大多数患者在接受治疗1~2年内仍不可避免地会出现疾病反弹,进展成难治的去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC),成为患者死亡的主要原因。雄激素受体剪接变异体7(androgen-receptor splice variant 7,AR-V7)是雄激素受体的一种异常剪接体,可表达一种C-端连接区域缺失、N-端区域仍保留转录活性的一种特殊蛋白,其异常表达可能是导致PCa发生去势抵抗的原因之一。

转移性去势抵抗性前列腺癌临床治疗标志物——雄激素受体剪接变异体7

随着越来越多的转移性前列腺癌患者对去势治疗抵抗,进入去势抵抗性前列腺癌(CRPC)阶段,治疗方案的合理选择及对治疗效果的预测变得越来越重要。大量研究发现雄激素受体变异体7(ARV7)参与CRPC发生与进展的过程。研究发现ARV7在CRPC中表达水平明显高于激素敏感性前列腺癌,在对阿比特龙、恩扎鲁胺治疗抵抗以及紫杉烷类药物化疗逃逸的机制中发挥了重要作用。此外,部分临床研究发现,ARV7的水平可提示不同治疗方案的预后:循环肿瘤细胞(CTC)ARV7阴性预示新型内分泌治疗与紫杉烷类化疗效果有效,而CTC ARV7阳性则预示新型内分泌治疗效果不佳。这些发现预示ARV7可成为临床医生对于CRPC治疗方案的选择以及判断预后等方面的生物标志物。

人生长激素释放激素受体剪接变异体1型对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

目的:探讨人生长激素释放激素受体剪接变异体1型(GHRHR SV1)对肝癌细胞系HepG2增殖的影响,阐明GHRHR SV1对人肿瘤细胞的促增殖作用。方法:将GHRHR SV1真核表达载体导入HepG2细胞建立HepG2-SV1细胞系。设计对照组(野生型HepG2)、空载质粒组(HepG2-pCDNA 3.0细胞系)和干扰组(HepG2-SV1细胞系)。采用PCR和Western blotting法鉴定HepG2-SV1细胞系,CCK-8法检测各组细胞的增殖率,克隆形成实验检测各组细胞的单克隆形成率,细胞划痕实验检测细胞的迁移率。结果:PCR与Western blotting法检测,构建的HepG2-SV1细胞系能稳定表达GHRHR SV1;CCK-8法检测,干扰组HepG2-SV1细胞系的增殖率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系(P<0.05);克隆形成实验,干扰组HepG2-SV1细胞系的单克隆形成率约为空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系的3.5倍(P<0.05);细胞划痕实验,所构建的干扰组HepG2-SV1细胞系的迁移率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系(P<0.05)。结论:GHRHR SV1能促进HepG2细胞的增殖。

AR剪切突变体、雄激素新生和miRNA在去势抵抗性前列腺癌发生中的作用

前列腺癌大多数患者在雄激素剥夺治疗（ADT）2~3年之后转为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），但是对于CRPC的发生机制目前仍不清楚。作者主要针对CRPC发病机制的研究现状做一综述，重点从雄激素受体（AR）的剪切变异体、雄激素的肿瘤内合成以及miRNA表达异常三个方面进行论述。

雄激素受体剪接变异体7在去势抵抗性前列腺癌中的作用及其临床意义

去势抵抗性前列腺癌(CRPC)是经过初次持续内分泌治疗后仍然进展的前列腺癌。CRPC的发生和发展机制极其复杂,目前尚未完全研究清楚,但雄激素受体(AR)信号的持续激活仍是重要因素。雄激素受体剪接变异体7(AR-V7)是AR重要的变异体之一,其与CRPC发生、发展存在密切联系,在促进AR的再活化、肿瘤的生长转移以及耐药性的产生中起着重要作用,与内分泌治疗的敏感性和总体存活率降低相关,是一种潜在评价指标,深入研究AR-V7与CRPC的关系,不仅可以指导现阶段CRPC的用药,还可以为CRPC的治疗提供新的途径和方向。

雄激素受体可变剪接异变体7与前列腺癌关系的研究进展

雄激素受体(AR)信号通路在前列腺癌(PCa)发生发展过程中起重要作用。AR信号转导途径的改变和重新激活是促进去势抵抗性前列腺癌(CRPC)发展和耐药性产生的核心因素。AR可变剪接异变体7(AR-V7)的表达是AR信号通路异常激活的重要原因之一,AR-V7具有与AR不同的结构及功能,在PCa发展、耐药和临床治疗中起着重要的推动作用,同时也具有作为CRPC生物标志物和治疗靶标的巨大潜力。现总结分析AR与AR-V7的结构和功能上的差异,以及在AR靶向药物作用下CRPC患者的疗效,为CRPC的治疗提供理论依据。阐述AR-V7在PCa治疗和耐药方面的主要研究进展及其在判断CRPC疗效和预后方面的作用,同时进一步分析AR-V7特异性检测在临床应用中的不足之处,以期取得技术上的进步和发展。

前列腺癌组织中雄激素受体剪接变异体7的表达及临床意义

目的探讨雄激素受体剪接变异体7(AR-V7)在前列腺癌组织中的表达及临床意义。方法收集2017年3月至2019年3月大连医科大学附属大连市中心医院泌尿外科48例患者的组织标本。其中良性前列腺增生18例(良性增生组)、局限性前列腺癌18例(局限癌组)、前列腺癌骨转移12例(骨转移癌组)。免疫组化染色检测各组AR-V7阳性表达;qRT-PCR检测各组AR-V7 mRNA的表达。结果免疫组化结果显示3组比较AR-V7阳性表达存在统计学差异(P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,与良性增生组比较,局限癌组AR-V7 mRNA表达增高(P<0.05);与良性增生组和局限癌组比较,骨转移癌组AR-V7 mRNA表达增高(P<0.05)。结论前列腺癌组织中AR-V7表达增高,且与前列腺癌的临床进展相关,提示AR-V7可能参与前列腺癌的临床进展和骨转移的发生。

miR-141-3p、KLF9异常表达对前列腺癌细胞株药物敏感性和雄激素受体表达的影响及靶向关系

目的观察miR-141-3p、Krüppel样因子9(KLF9)对前列腺癌细胞株药物敏感性、雄激素受体(AR)表达的影响,验证miR-141-3p、KLF9之间的靶向关系,以探讨miR-141-3p、KLF9对PCa药物敏感性的调控作用及机制。方法选择雄激素敏感且表达AR的LNCaP细胞株。将细胞分为miR-141-3p低表达组、miR-141-3p正常组、KLF9过表达组、KLF9正常组,采用脂质体转染法分别转染miR-141-3p-inhibitor、inhibitor阴性对照物(inhibitor-NC)、KLF9过表达质粒、空白质粒。上述各组细胞加入不同浓度(0、10、25、50、75、100µmol/L)比卡鲁胺或(0.5、1.0、2.5、5.0 nmol/L)多西他赛后培养48 h,检测各组细胞OD值,计算细胞增殖率(反映药物敏感性)。采用qRT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中AR及AR-V7。采用TargetScan数据库预测miR-141-3p与KLF9是否存在结合位点,然后采用荧光素酶报告基因实验验证miR-141-3p与KLF9的靶向调控关系[将LNCaP细胞株分别分为A、B、C、D组,A组先后转染野生型KLF9荧光素酶报告基因质粒(KLF9-WT)、inhibitor-NC,B组先后转染KLF9-WT、miR-141-3p-inhibitor,C组先后转染突变型KLF9荧光素酶报告基因质粒(KLF9-Mut)、inhibitor-NC,D组先后转染KLF9-Mut、miR-141-3p-inhibitor,转染24 h后检测各组荧光素酶活性]。通过细胞功能回复实验进一步验证miR-141-3p通过靶向调控KLF9抑制前列腺癌细胞药物敏感性[将LNCaP细胞株分别分为a、b、c、d组,a组先后转染si-KLF9阴性对照(si-Ctrl)、inhibitor-NC,b组先后转染si-Ctrl、miR-141-3p-inhibitor,c组先后转染si-KLF9、inhibitor-NC,d组先后转染si-KLF9、miR-141-3p-inhibitor,转染24 h后分别使用75µmol/L比卡鲁胺或2.5 nmol/L多西他赛处理细胞48 h,使用CCK-8法检测细胞OD值,并计算细胞增殖率]。结果LNCaP细胞培养48 h,在无药物加入时,miR-141-3p低表达组细胞增殖率低于miR-141-3p正常组(P均<0.05),KLF9过表达组细胞增殖率低于KLF9正常组(P均<0.05);随着药物浓度升高,各组细胞增殖率呈下降趋势(P均<0.05);在同等药物浓度情况下,miR-141-3p低表达组细胞增殖率低于miR-141-3p正常组(P均<0.05),KLF9过表达组细胞增殖率低于KLF9正常组(P均<0.05)。LNCaP细胞培养48 h,与不加入药物的miR-141-3p正常组相比,加入75、100µmol/L比卡鲁胺的miR-141-3p正常组AR相对表达量升高(P均<0.05),加入50、75、100µmol/L比卡鲁胺的miR-141-3p正常组AR-V7相对表达量升高(P均<0.05);加入0.5、1.0、2.5、5.0 nmol/L多西他赛的miR-141-3p正常组AR及AR-V7相对表达量升高(P均<0.05)。miR-141-3p低表达组的AR及AR-V7相对表达量低于加入同药物浓度的miR-141-3p正常组(P均<0.05),KLF9过表达组的AR及AR-V7相对表达量低于加入同药物浓度的KLF9正常组(P均<0.05)。TargetScan数据库预测miR-141-3p与KLF9存在结合位点,双荧光素酶报告实验显示,B组的相对荧光活性高于A组、C组及D组(P均<0.05)。功能回复实验结果显示,d组的细胞增殖率高于b组(P均<0.05),低于c组(P均<0.05),但与a组差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-141-3p低表达、KLF9过表达均可增强LNCaP细胞株的药物敏感性,并可抑制LNCaP细胞株AR和AR-V7的表达,miR-141-3p和KLF9存在靶向关系,miR-141-3p可靶向KLF9抑制LNCaP细胞药物敏感性,可能是通过促进AR-V7的表达实现的。

体外激酶实验筛选p21活化激酶6对雄激素受体的磷酸化位点

目的构建雄激素受体(AR)的点突变原核表达质粒,以体外激酶实验分析筛选p21活化激酶6(PAK6)对雄激素受体的磷酸化位点,更好的研究PAK6对AR的磷酸化所发挥的生物学功能。方法利用体外激酶实验分析PAK6对AR的较小磷酸化区域,并利用重叠延伸PCR的方法构建可能的磷酸化定点突变体;然后,体外纯化带有GST标签的突变体蛋白,及体外激酶实验筛选PAK6对AR的磷酸化位点。结果证明质粒构建成功,构建雄激素受体定点突变体,确定PAK6磷酸化雄激素受体位点。结论成功筛选PAK6对AR的磷酸化位点是578位丝氨酸。

雌激素受体β与乳腺癌

目的 探讨雌激素受体 β(ERβ)在乳腺癌方面的研究进展。 方法 采用文献回顾方法 ,对ERβ的生物学功能、变异 ,及其乳腺癌发生、发展、预后评估及内分泌治疗反应方面的可能作用加以综述。结果 ERβ是类固醇激素受体超家族的新成员 ,可能在乳腺癌发生、发展、预后评估及内分泌治疗反应方面具有重要作用。结论 ERβ是一种新的乳腺癌预后评估指标。

AR-V7水平改变与转移性前列腺癌患者应用地塞米松联合阿比特龙治疗的敏感性及其与预后的关系

目的:探讨雄激素受体剪接变异体7(AR-V7)表达改变与转移性前列腺癌(mPC)患者应用阿比特龙联合地塞米松(AA+D)治疗的敏感性及其与预后的关系。方法:选取80例mPC患者为研究对象,依照免疫组织化学检测结果分为AR-V7阳性组(n=29)与AR-V7阴性组(n=51),两组患者均予以AA+D治疗。比较两组患者临床病理特征及预后,分析影响预后的相关因素。结果:AR-V7阳性组病程长于AR-V7阴性组(P<0.05);舒张压水平、浸润深度、mGPS评分高于AR-V7阴性组(P<0.05);肿瘤最大径≥2 cm、有吸烟史、淋巴结转移患者比例高于AR-V7阴性组(P<0.05)。随访1~5年,AR-V7阳性组PFS及OS短于AR-V7阴性组(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示,T分期和AR-V7阳性是影响mPC患者总生存期的独立因素(P<0.05)。结论:AR-V7表达情况与mPC患者的病情严重程度紧密相关,同时影响地塞米松联合阿比特龙的治疗效果,可作为衡量mPC预后的敏感标志物之一。

前列腺癌组织中雄激素受体剪接变异体7表达对转移性前列腺癌患者激素敏感时间的预测作用

目的 探讨前列腺癌组织中雄激素受体剪接变异体7（AR-V7）的表达对转移性前列腺癌患者激素敏感时间的预测作用.方法 回顾性收集2002年1月至2010年6月经前列腺穿刺活检确诊的113例晚期转移性前列腺癌患者的临床病理资料.确诊时年龄43 ～ 84岁,中位年龄70岁.确诊时血清PSA值3.0～6 006.2 μg/L,中位值120.0 μg/L.临床分期M1a期5例（4.4％）,M1b期94例（83.2％）,M1.期14例（12.4％）.患者均接受内分泌治疗.利用免疫组化技术和鼠抗人AR-V7特异性抗体检测前列腺癌组织中AR-V7的表达.利用Cox比例风险模型分析患者确诊年龄、确诊PSA值、确诊Gleason评分、临床分期、内分泌治疗过程中PSA最低值、到达PSA最低值时间以及PSA半衰期对激素敏感时间的预测作用.采用Kaplan-Meier法分析AR-V7的表达对激素敏感时间的影响,并用Log-rank法对结果进行显著性检验.结果 本组患者内分泌治疗过程中PSA最低值为0.0～143.0tμg/L,中位值0.7μg/L.到达PSA最低值的时间为0.9～71.0个月,中位时间8.1个月.PSA半衰期为0.1～41.0个月,中位值1.0个月.经过中位27（2～132）个月的随访后,100例患者进展至去势抵抗性前列腺癌,中位激素敏感时间为24（2～ 132）个月.113例前列腺癌组织中,23例（20.4％）阳性表达AR-V7.Cox多因素分析结果显示,前列腺癌组织中AR-V7的表达（P=0.004,HR=2.223）和内分泌治疗过程中PSA最低值（P=0.035,HR=1.011）是晚期转移性前列腺癌患者激素敏感时间的独立预测因素.前列腺癌组织中表达AR-V7和不表达AR-V7组患者的中位激素敏感时间分别为（16.0±3.4）和（30.0±6.0）个月,差异有统计学意义（P=0.001）.结论 前列腺癌组织中AR-V7的表达和内分泌治疗过程中PSA最低值为晚期转移性前列腺癌患者激素敏感时间的独立预测因素.AR-V7可能为晚期前列腺癌的治疗新靶点.

组蛋白去乙酰化酶抑制剂CUDC-101对去势抵抗性前列腺癌雄激素受体剪切变异体7表达的影响

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂CUDC－101对去势抵抗性前列腺癌（castration－resistant prostate cancer，CRPC）雄激素受体剪切变异体7 （androgen receptor splice variant 7，AR－V7）表达的影响。方法2015年4月至2016年4月采用免疫印迹法检测前列腺癌细胞株PC－3、VCaP、22Rv1、LNCap中AR－V7蛋白表达情况，并选取表达量最高的细胞株进行后续实验。通过细胞增殖与活性实验对组蛋白去乙酰化酶抑制剂CUDC－101、组蛋白甲基化抑制剂DZNeP、DNA甲基化抑制剂吉西他滨、组蛋白乙酰化转移酶抑制剂MG149进行筛选，选出能够降低CRPC细胞中AR－V7蛋白表达的抑制剂。分别将30、300 nmol的CUDC－101与1、10、20μmol的MDV3100联合使用处理可表达AR－V7的细胞株，检测其对细胞生长的抑制作用。结果免疫印迹实验结果显示AR－V7蛋白仅在CRPC细胞株22Rv1中阳性表达。采用不同的表观遗传抑制剂处理22Rv1细胞，仅CUDC－101处理后AR－V7的表达量明显降低并趋于阴性，其他抑制剂对AR－V7的表达无影响。在细胞增殖与活性实验中，30 nmol CUDC－101与1、10、20μmol的MDV3100联合使用对22Rv1细胞株的抑制率分别为10%、35%和45%，高于单独使用MDV3100的5%、28%和42%，差异有统计学意义（P〈0.05）。300 nmol CUDC－101与1、10、20μmol MDV3100联合使用对22Rv1的抑制率分别为30%、60%和65%，明显高于单独使用MDV3100，差异有统计学意义（P〈0.05）。结论CUDC－101可以抑制CRPC中AR－V7的表达。

促甲状腺激素β剪接变体在自身免疫性甲状腺炎小鼠甲状腺中的表达

目的探讨促甲状腺激素（TSH）β剪接变体在甲状腺球蛋白（强）免疫诱发的自身免疫性甲状腺炎小鼠甲状腺中的表达及碘过量对表达的影响，了解TSHβ剪接变体是否参与了自身免疫性甲状腺炎发生的病理过程。方法选7～8周龄的BALB／c小鼠48只，雌雄各24只，体质量20—25g。根据小鼠的体质量和性别，采用随机数字表法分为4组，每组12只，雌雄各半。对照组：饮去离子水；免疫（TG）组：饮去离子水，每只小鼠在8周龄时注射0．1mgTg皮下免疫，分别在11周龄和15周龄时各加强免疫1次；高碘（HI）组：饮用0．05％碘化钠（NaI）水；联合（TG＋HI）组：饮0．05％NaI水，免疫同TG组。喂养8周后处死小鼠，采集外周血，通过化学免疫发光法测量血清中总甲状腺素和游离甲状腺素（TT4、FT4）、总三碘甲腺原氨酸和游离三碘甲腺原氨酸（TT3、FT3）水平；取小鼠甲状腺，冰冻切片后用于HE染色，光镜下观察甲状腺细胞形态改变。SYBRGreen荧光实时定量（RT）-PCR检测TSHβ剪接变体表达。结果肉眼下，与对照组比较，HI组和TG＋HI组小鼠甲状腺明显肿大，颜色暗红。光镜下，对照组小鼠甲状腺滤泡大小较一致，上皮细胞多呈立方形，滤泡腔内含丰富胶质，无淋巴细胞浸润；TG组甲状腺滤泡较一致，上皮细胞立方形，可见单个散在淋巴细胞；HI组可见甲状腺滤泡胶质蓄积性扩张，上皮细胞呈低立方状或扁平状，但少见淋巴细胞浸润；TG＋HI组甲状腺内多为胶质蓄积性大滤泡，上皮细胞扁平状，可见滤泡结构破坏及局部淋巴细胞浸润。小鼠FT3、FT4、FT4和TSHβ剪接变体表达组间比较差异有统计学意义（F=4．00、12．54、31．92、214．29，P均〈0．05）。与对照组比较，TG组TT3、TT4、FT4和TSHβ剪接变体表达升高（nmol／L：0．92±0．07比1．30±0．33、67．75±11．91比95．60±14．10；pmol／L：54．07±3．67比154．80±0．01；×10-3：4．1l±0．32比8．38±0．22；t值分别为-2．24、-3．02、-54．87、-19．11，P均〈0．05）；HI组TT4下降（nmol／L：67．75±11．91比45．50±3．85，t=3．55，P〈0．05）；TG＋HI组FT4和TSHB剪接变体表达升高（pmol／L：54．07±3．67比139．46±30．00；×10-3：4．11±0．32比5．33±1．47；t值分别为-5．65、-5．95，P均〈0．05）。结论Tg诱发了BALB／c小鼠自身免疫性甲状腺炎症反应，小鼠甲状腺中TSHβ剪接变体的表达明显升高，高碘可以加重Tg的这种反应，TSHβ剪接变体参与了自身免疫性甲状腺炎的病理过程。

雄激素受体剪接变异体7与雄激素受体比值预测前列腺癌预后的意义分析

目的:探讨雄激素受体剪接变异体7(AR-V7)与雄激素受体(AR)比值(AR-V7/AR)对前列腺癌预后的预测价值。方法:选择2013年3月至2018年3月广东省高州市人民医院收治的105例接受内分泌初治的前列腺癌患者,以免疫组织化学法检测活检穿刺标本的AR、AR-V7表达情况,分析AR、AR-V7、AR-V7/AR与患者预后的关系,并对影响前列腺癌预后相关因素采用Cox模型进行分析。结果:AR阳性率为59.0%(62/105),AR-V7阳性率为19.0%(20/105)。随访15~61(44.8 ± 10.1)个月,AR-V7阳性者的无进展生存时间(PFS)以及总生存时间(OS)均较阴性者明显缩短[(10.8 ± 2.2)个月比(25.0 ± 3.4)个月、(20.3 ± 5.1)个月比(42.8 ± 7.4)个月],差异有统计学意义( P<0.01),而高AR-V7/AR者的PFS以及OS较低AR-V7/AR者亦明显缩短[(12.5 ± 3.2)个月比(24.9 ± 5.5)个月、(22.5 ± 4.6)个月比(42.1 ± 8.3)个月],差异有统计学意义( P<0.01)。Cox多因素分析提示T 4期( HR = 2.618,95% CI 1.362 ~ 4.986, P<0.01)、高AR-V7/AR( HR = 5.799,95% CI 2.541 ~ 13.253, P<0.01)可作为影响前列腺癌不良预后的独立危险因素。 结论:接受内分泌初治的前列腺癌患者如AR-V7阳性、高AR-V7/AR时则PFS、OS可缩短,高AR-V7/AR可成为评估该类患者预后不良的相关危险因素。

GHRHR-SV1抗体的制备及其蛋白在黑色素瘤细胞中的表达

目的:制备生长激素释放激素受体剪接变异体1(GHRHR-SV1)抗体,并检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞中的表达情况,为后续的肿瘤机制研究奠定基础。方法:设计GHRHR-SV1基因序列,将其插入质粒pET-32a(+)中,构建pET-GHRHR-SV1重组载体,经PCR及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0mmol·L^(-1)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG);诱导1、2、4和6h,并在37℃、30℃和25℃不同温度下进行诱导;观察目的蛋白表达的最佳IPTG浓度、时间和温度。亲和层析纯化重组蛋白,将纯化后的蛋白免疫家兔,制备兔多克隆抗体,ELISA法检测该抗体效价,Western blotting法检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞系B16-F10中的表达情况。结果:重组载体pET-GHRHR-SV1构建成功。在IPTG浓度为2.0mmol·L^(-1)时目的蛋白的表达量最高;IPTG诱导蛋白表达2h时,蛋白表达量最大;当温度为25℃时,蛋白的表达量最大。诱导表达的蛋白相对分子质量约为24 000,纯化后纯度为80%,GHRHR-SV1抗体效价为1∶1 600 000,B16-F10细胞中有GHRHR-SV1蛋白表达。结论:成功制备pETGHRHR-SV1重组载体。GHRHR-SV1蛋白在IPTG浓度为2.0mmol·L^(-1)、诱导时间为2h和温度为25℃的条件下表达最佳。成功制备了高效价的GHRHR-SV1抗体。黑色素瘤细胞系中有GHRHR-SV1蛋白表达。

生长激素释放激素受体剪接变异体1在子宫内膜异位症中的表达

目的:研究生长激素释放激素受体剪接变体1(SV1),一种生长激素释放激素(GHRH)受体的变体在子宫内膜异位症的表达模式。方法:在位和异位子宫内膜组织、腹膜B细胞采自有或没有子宫内膜异位症的妇女,正常卵巢组织采自没有子宫内膜异位症的妇女。分离异位子宫内膜基质干细胞(ESC)并加入GHRH培养,GHRH和SV1在样品组织的基因表达由RT-PCR检测,BrdU的摄入由特定的分析系统检测。结果:54份子宫内膜异位组织中有34份(63.0%)表达SV1 mRNA,显著高于在位内膜组织(4.3%)和正常卵巢组织(0.0%)。GHRH mRNA在异位子宫内膜组织的表达为22.2%(12/54),在位内膜组织中为25.9%,而在正常卵巢组织中为100.0%(14/14)和腹膜B细胞为81.3%(13/16)。GHRH能刺激表达SV1的ESC增加BrdU摄入。结论:GHRH和SV1在异位内膜表达谱不同于在位内膜,GHRH激活SV1并刺激细胞的增殖。

Study on the Developmental Changes of Muscular GHR mRNA Expression in Sheep

[ Objective] The study aimed to explore the expression of muscular growth hormone receptor gene （GHR） in sheep at the early stage of growth and development. [Method] The GHR mRNA expression levels in longissimus dorsal muscles of male Kazak sheep and Xinjiang fine wool sheep with different ages were quantitatively analyzed by real time PCR. [ Result] Sheep GHR mRNA expression level in longissimus dorsal muscle increased firstly followed by decline, and then kept steady until the end of the experiment, with the expression peak appearing on postnatal day 30. The GHR mRNA expression level of Kazak sheep was extremely lower than that of Xingjiang fine wool sheep from 2 to 90 days old （ P 〈0.01 ）. E Conclusionl Both age and breed had great effects on the expression of muscular GHR gene in sheep.