ST段抬高型心肌梗死患者血运重建前后血清生成素Ⅱ组织激肽释放酶1水平变化及与预后的关系

目的探讨直接经皮冠状动脉介入(PCI)术前、术后血清血管生成素Ⅱ(AngⅡ)、组织激肽释放酶1(KLK1)水平变化以及对ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者6个月内发生主要不良心血管事件(MACE)的预警价值.方法前瞻性选择2018年1月至2019年3月在广州市第一人民医院接受直接PCI术的STEMI患者220例,记录术前5 min和术后24 h血清AngⅡ和KLK1水平,随访6个月,记录MACE发生情况.结果与术前相比,STEMI患者血清AngⅡ总体水平(3.15±0.97)μg/L降低,而血清KLK1总体水平(27.97±12.86)ng/L升高(P<0.05).术前和术后血清AngⅡ水平与Gensini评分均呈正相关性(r=0.578,0.337,P<0.05),且随着心肌梗死面积增加术前血清AngⅡ增加(P<0.05).术前血清KLK1水平与Gensini评分具有负相关性(r=-0.346,P<0.05);且随着心肌梗死范围的扩大血清KLK1水平逐渐降低(P<0.05).随访6个月,MACE组患者术后血清AngⅡ降低率和KLK1升高率分别为(-29.14±17.52)%、(33.46±14.51)%,高于非MACE组患者(P<0.05).术后血清AngⅡ降低率(OR=6.895,95%CI 2.178~13.994)和KLK1升高率(OR=19.165,95%CI 2.469~36.883)是MACE发生的独立影响因子(P<0.05).经受试者工作特征(ROC)曲线分析,术后AngⅡ联合KLK1变化率对术后6个月发生MACE预测的ROC曲线下面积(AUC)为0.913(95%CI0.837~0.990).结论动态观察血清AngⅡ和KLK1水平变化,对于STEMI患者PCI术后6个月MACE的发生风险有一定的预测价值.

含组织激肽释放酶1表达载体诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的探讨组织激肽释放酶1(KLK1)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的影响。方法选取2015年3—7月购买的大鼠BMSCs,将大鼠BMSC细胞分为3组即正常组、组织激肽释放酶1组、5-Aza组。采用RT-PCR分别对诱导培养后的大鼠BMSCs进行心肌细胞特异性蛋白Actin、c-Tn I和Desmin的检测,并用Western blot免疫印迹分析c-Tn T蛋白表达量。结果 RT-PCR检测显示,5-Aza诱导的BMSCs(1.964±0.805)在心肌特异性蛋白Actin RNA、c-Tn I RNA和Desmin RNA的表达均高于空白组(1.000±0.000)(P<0.05),KLK1诱导组(2.633±0.582)以上蛋白的RNA表达量又显著高于5-Aza诱导组(P<0.05)。Western blot结果显示,5-Aza诱导组c-Tn T蛋白的表达(0.799±0.101)高于空白组(0.112±0.001)(P<0.001),KLK1诱导组(1.294±0.134)显著高于5-Aza组。差异有统计学意义(P<0.001)。结论 5-Aza能有效使BMSCs向心肌样细胞诱导分化,KLK1也能诱导BMSCs向心肌样细胞分化。KLK1较5-Aza诱导的BMSCs在心肌细胞特异性蛋白RNA表达,心肌特异性蛋白T表达其心肌特异性更为突出。

多发性硬化患者血清激肽释放酶1和6水平分析

目的:测定多发性硬化(MS)初发组与复发组患者血清激肽释放酶1(klk1)与激肽释放酶6(klk6)的水平,研究二者与MS复发的关系。方法:采用ELISA法测定健康对照者、其他神经系统疾病患者、初发MS患者和复发MS患者各50名外周血血清klk1和klk6水平。结果:4组患者血清klk1和klk6水平比较,差异均有统计学意义(F=158.940和61.490,P<0.001);MS初发组与复发组血清klk1和klk6水平均高于其他2组,且MS复发组高于初发组(P<0.05)。MS患者血清klk1、klk6水平分别与MS的复发呈正关联(rP=0.555和0.447,P<0.05)。结论:血清klk1、klk6水平与MS复发相关,可能作为反映MS复发的指标。

组织激肽释放酶1转染骨髓间充质干细胞的病毒感染复数选择

背景:血管舒缓素即组织激肽释放酶1,是组织激肽释放酶-激肽系统重要组成部分之一。有研究表明血管舒缓素通过促进血管新生,抑制心肌炎症产生等发挥其对心血管系统的保护作用,但并未从干细胞诱导分化方面进行探讨。目的:实验利用已构建的腺病毒载体,将其携带的血管舒缓素基因转染到大鼠骨髓间充质干细胞上,观察其是否成功转染及转染率如何。方法:以腺病毒作为载体,将目的基因血管舒缓素转染到大鼠骨髓间充质干细胞上,并采用荧光显微镜、四甲基偶氮唑盐法和流式细胞技术观察病毒对细胞的转染效果,以确定最佳的病毒感染复数。结果与结论:荧光显微镜下观察到腺病毒携带的血管舒缓素目的基因成功转染到大鼠骨髓间充质干细胞上;流式细胞仪结果显示转染率跟病毒感染复数值的大小有关系,当病毒感染复数为150时,转染率为80.8%;四甲基偶氮唑盐法结果提示,病毒感染复数为200时,细胞生长受到明显的抑制。结果证实,腺病毒介导的血管舒缓素能成功转染到大鼠骨髓间充质干细胞上,且最佳的病毒感染复数为150。

含人组织激肽释放酶1和基质金属蛋白酶组织抑制物1基因共表达载体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

背景和目的前期研究表明人组织激肽释放酶1（hTK1）基因过表达具有部分抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和改善血管再狭窄的作用,但联合基质金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP1）对VSMC增殖是否具有协同效应,目前尚不明了。本研究构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组腺病毒载体,并观察其在大鼠VSMC中的表达,以及对VSMC生长增殖影响。方法采用限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ,酶切含启动子CMV和hTIMP1基因片段的重组穿梭质粒,经PCR、连接、热激、转化等亚克隆至pDC316-hTK1质粒中,构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组穿梭质粒。将骨架质粒和穿梭质粒于293A细胞包装重组腺病毒载体。感染大鼠VSMC后,采用RealtimePCR法、Western blot法检测目的基因转录、蛋白表达。细胞计数法和四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定细胞增殖。结果经PCR、酶切和测序法证实,含双基因（hTK1和hTIMP1）的重组病毒穿梭质构建正确。在293A细胞中成功包装出重组腺病毒载体Ad-hTK1-hTIMP1。感染VSMC后,双基因（hTK1和hTIMP1）的转录水平表达呈现随感染复数（50~150 MOI）和时间（1~3d）依赖性地增加,目的蛋白（hTK1和hTIMP1）亦呈现浓度依赖性地高表达。与单基因载体（Ad-hTK1或Ad-hTIMP1）相比较,双基因载体可明显抑制血小板源性生长因子（PDGF）诱导的大鼠VSMC增殖（P〈0.01）,其峰值抑制率为45.7%。结论首次成功构建并包装重组腺病毒双基因载体Ad-hTK1-hTIMP1。感染细胞后,其目的基因和蛋白均呈现独立高表达,并具有协同抑制VSMC增殖的效应,为血管增殖性疾病的多基因干预治疗实验提供一个新工具。

血浆激肽释放酶B1和缓激肽受体B2基因多态性及体质指数与老年原发性高血压的关系

目的探讨血浆激肽释放酶B1(KLKB1)和缓激肽受体B2(BDKRB2)基因多态性及体质指数(BMI)与老年原发性高血压的关系。方法应用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(RFLP-PCR)的方法检测103例重庆地区老年原发性高血压患者和103例老年正常对照者的KLKB1基因rs2304595和BDKRB2基因rs1799722多态性。结果与正常对照组相比,老年原发性高血压组收缩压和体质指数均高于正常对照组(P<0.05);老年原发性高血压男性亚组rs2304595位点GG基因型和G等位基因频率无统计学差异(P>0.05);老年原发性高血压女性亚组GG基因型和G等位基因频率有显著统计学差异(P<0.01);而rs1799722位点的基因多态性无统计学差异(P>0.05)。Logistic回归分析表明:rs2304595位点GG基因型和BMI均不同程度的增加老年原发性高血压的发病风险,二者之间存在协同作用。结论 KLKB1基因rs2304595位点GG基因型和G等位基因可能是老年汉族女性原发性高血压发病的一个遗传标志,并且GG基因型和BMI对老年原发性高血压发病存在协同作用;而BDKRB2基因rs1799722基因多态性与老年原发性高血压发病的关系尚不明确。

人组织激肽释放酶基因重组腺病毒转染对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCSHR)增殖和迁移的影响。方法:自行构建双顺反子重组腺病毒载体,携带强绿色荧光蛋白(EGFP)标志基因和目的基因hKLK1;用细胞计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞生长周期;蛋白免疫印迹法(Western blotting)测定细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1的表达。采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移。结果:(1)hKLK1基因转移呈感染复数依赖性(20-100MOI)抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR生长,100MOI时抑制率为39.3%;呈时间依赖性抑制VSMCSHR生长,第5d时达高峰,抑制率为35.2%。(2)hKLK1基因转移可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,峰值抑制率为30.2%(P<0.01);细胞周期阻滞于G0/G1期的VSMCSHR明显增多,最大阻滞率为36.4%(P<0.01),而缓激肽B2受体特异性阻断剂Hoe140逆转了hKLK的抑制作用。(3)hKLK1基因转移明显上调PDGF-BB诱导VSMCSHR的p27Kip1、p21Cip1表达,Hoe140明显降低p27Kip1、p21Cip1表达。(4)hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140不影响该抑制作用。结论:hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,主要由缓激肽B2受体介导的,通过上调细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1表达的途径。而hKLK1基因转移抑制VSMCSHR迁移效应可能不通过B2受体。

人组织激肽释放酶基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的探讨重组腺病毒介导的人激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)的血管平滑肌细胞(VSMCSHR)迁移的影响。方法自行构建携带目的基因hKLK1和强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双顺反子重组腺病毒载体。采用组织贴块法培养SHR胸主动脉血管平滑肌细胞,接种第3～6代VSMCSHR于6孔板,分别加入含hKLK1重组腺病毒和对照病毒干预,3d后加入PDGF-BB诱导24h,采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移,并加入缓激肽受体B2特异性阻断剂Hoe140。RT-PCR法测定缓激肽B1受体、B2受体的mRNA表达。结果hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140干预不产生影响。PDGF-BB诱导的VSMCSHR缓激肽B2受体mRNA表达明显增加(P<0.001),而Hoe140可明显降低其表达(P<0.01)。结论重组腺病毒介导的hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR迁移,这一效应可能不通过B2受体途径介导。

组织激肽释放酶改善大鼠心肌重塑的实验研究

目的探讨重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶(h TK1)基因过表达对大鼠心肌梗死后心肌结构、心肌胶原纤维以及新生血管的影响。方法结扎雄性Sprague-Dawley大鼠的左冠状动脉前降支,建立急性心肌梗死模型。将含h TK1基因的重组腺病毒(Ad-h TK1)和对照病毒(1×1010PFU)注射到心肌梗死部位及其周边区域。4周后处死大鼠,取出心脏、称量、切片;通过荧光显微镜观察心肌组织的绿色荧光表达;Western blot测定h TK1蛋白表达;HE染色观察心肌组织结构,天然猩红染色观察胶原含量、分布,免疫组化法检测新生血管密度。结果仅在Ad-h TK1组大鼠的心肌既有绿色荧光,又有h TK1蛋白表达。假手术组大鼠的心脏质量、左室质量、心肌胶原分布显著低于心梗模型组,新生血管密度明显高于模型组。但与对照病毒组相比,Ad-h TK1组大鼠的心脏质量、左室质量、左室质量指数和心肌胶原纤维含量明显降低(P<0.05),心肌结构和新生血管密度明显改善(P<0.05)。结论重组腺病毒介导的组织激肽释放酶基因过表达可改善心肌结构,增加梗死周围心肌的新生血管形成,改善梗死后心肌重构。

结直肠癌组织中血浆激肽释放酶B1蛋白的表达变化及其临床意义

目的 观察结直肠癌组织中血浆激肽释放酶B1(KLKB1)蛋白的表达变化,并探讨其临床意义。方法 结直肠癌患者86例,均接受根治性手术治疗,术中留取癌组织及癌旁组织,采用免疫组织化学法检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中KLKB1蛋白,分析KLKB1蛋白阳性表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系及相关性。结果 结直肠癌组织及癌旁正常组织中KLKB1蛋白阳性表达率分别为45.3%、72.1%,两者相比,P<0.05。KLKB1蛋白阳性表达与结直肠癌患者肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期有关,且呈负相关关系(r分别为-0.260、-0.231、-0.231,P均<0.05)。结论 结直肠癌组织中KLKB1蛋白呈低表达,可能参与了结直肠癌的发生发展。

自拟益气养阴清热利湿方药对IgA肾病大鼠肾脏局部激肽释放酶-激肽系统的影响

目的:探讨益气养阴清热利湿方药对IgA肾病大鼠的治疗作用及对肾脏局部激肽释放酶-激肽系统系统的影响。方法:将SD大鼠随机分为4组,对照组、模型组、西药组、中药组,各组按相应药物剂量灌胃;造模前和第7、9、13、17周末检测24h尿蛋白定量,第17周末行肾组织IgA免疫荧光检测,并应用RT-PCR法检测肾组织KLK1和BK的表达水平。结果:与模型组比较,中药组、西药组IgA免疫荧光强度显著下降,KLK1和BK的表达水平显著增高(P<0.05)。结论:益气养阴清热利湿方药可能是通过激活肾脏局部KKS,达到延缓肾脏病理进展,发挥对IgA肾病的治疗作用。

人组织激肽释放酶在Pichia pastoris酵母中的表达

通过将人组织激肽释放酶(hKLK1)原编码序列克隆入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-KLK1。分别用SalⅠ及BglⅡ酶切线性化后电转化酵母菌株GS115,经MD平板及含不同抗性浓度G418的YPD平板上培养筛选,获得抗3mg/mlG418Mut+型分泌表达hKLK1的重组酵母菌4株,抗1mg/mlG418Muts型分泌表达hKLK1的酵母菌3株。酶活性测定数据表明:高拷贝转化子重组蛋白表达量高于低拷贝转化子;Mut+型转化子重组蛋白表达量高于Muts型转化子;且当甲醇诱导体积分数为2%时,重组蛋白的表达量最高。进一步的Western-blotting分析证明,表达的重组hKLK1分子质量正确,能被特异的抗体识别。

血清KLK1、SOX6水平与急性冠状动脉综合征患者经皮冠状动脉介入治疗术后预后的关系

目的探讨组织激肽释放酶1(KLK1)、性别决定区Y框相关高迁移率族蛋白6(SOX6)与急性冠状动脉综合征(ACS)患者经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后预后的关系。方法选择2019年1月至2020年11月期间河北大学附属医院收治的ACS患者122例作为研究对象,根据1年内是否发生主要不良心血管事件(MACE)分为预后良好组(96例)和预后不良组(26例)。采用酶联免疫吸附法检测血清KLK1、SOX6水平;采用受试者工作特征(ROC)曲线评估KLK1、SOX6对ACS患者PCI后MACE的预测价值;Kaplan-Meier法比较不同KLK1、SOX6水平ACS患者的预后情况;Cox多因素回归分析ACS患者预后的影响因素。结果预后不良组血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平高于预后良好组(t=13.311,P<0.05),血清KLK1、SOX6水平均低于预后良好组(t=5.855、6.205,P<0.05)。预后良好组植入支架数低于预后不良组(t=2.369,P<0.05)。ROC曲线显示,KLK1、SOX6对预后预测的AUC为0.798、0.760,两者联合对预后预测的AUC为0.909,高于单独预测(Z=2.925、3.639,P<0.05),敏感度、特异度分别为90.62%、76.92%。Kaplan-Meier分析显示,KLK1低表达ACS患者MACE的发生率高于KLK1高表达者(Log rankχ^(2)=8.674,P<0.01),SOX6低表达ACS患者MACE的发生率高于SOX6高表达者(Log rankχ^(2)=23.539,P<0.01)。Cox回归分析显示,KLK1、SOX6均是ACS患者PCI治疗后发生MACE的保护因素(HR=0.725、0.618,P<0.05)。结论KLK1、SOX6在预后不良的PCI后ACS患者血清中表达均降低,两者联合对MACE的发生具有一定的预测价值,临床可用于ACS患者PCI术后是否发生MACE的早期评估。

老年急性心力衰竭患者血清Clusterin、KLK1水平及对病情和预后的评估价值

目的探究血清簇集蛋白(Clusterin)、组织激肽释放酶1(KLK1)与老年急性心力衰竭(AHF)病情关系及对患者预后的评估价值。方法选取2019年7月-2021年10月河北医科大学第二医院心血管内四科收治老年AHF患者80例为研究对象(AHF组),另选取同期在医院行健康体检者80例为健康对照组。根据心功能将AHF患者分为轻度亚组(n=37)和重度亚组(n=43),依据患者是否发生终点事件分为终点事件亚组(n=36)和非终点事件亚组(n=44)。比较各组间的基本资料及血清Clusterin、KLK1水平;Spearman相关性分析AHF患者血清Clusterin、KLK1水平与病情程度之间的关系;Logistic回归分析AHF患者发生终点事件的影响因素;受试者工作特征曲线(ROC)分析血清Clusterin、KLK1对AHF患者预后的评估价值。结果AHF组SCr、TnI、CK-MB、NT-proBNP、LVEDD、BNP、Clusterin水平显著高于健康对照组(t/P=8.439/<0.001、31.607/<0.001、5.212/<0.001、15.676/<0.001、11.106/<0.001、17.847/<0.001、12.792/<0.001),LVEF、KLK1水平显著低于健康对照组(t/P=3.900/<0.001、8.963/<0.001);终点事件亚组TnI、CK-MB、NT-proBNP、BNP、Clusterin水平均显著高于非终点事件亚组(t/P=8.389/<0.001、3.517/0.001、10.993/<0.001、5.626/<0.001、7.303/<0.001),LVEF、KLK1水平显著低于非终点事件亚组(t/P=2.749/0.007、6.225/<0.001);与轻度亚组患者比较,重度亚组患者血清Clusterin水平显著升高,KLK1水平显著降低(t/P=8.236/<0.001、12.703/<0.001);Spearman相关性分析结果显示,AHF患者血清Clusterin水平与病情程度呈显著正相关(r=0.613,P<0.01),而血清KLK1水平与病情程度呈显著负相关(r=-0.680,P<0.01);Logistic回归分析结果显示,BNP高、Clusterin高、KLK1低是影响AHF患者发展为不良终点事件的危险因素[OR(95%CI)=1.401(1.132~1.735)、1.545(1.219~1.959)、1.624(1.246~2.116)];ROC曲线结果显示,血清Clusterin、KLK1及二者联合评估AHF患者预后的曲线下面积(AUC)分别为0.879、0.834、0.964,二者联合评估AHF患者预后的AUC大于单项预测(Z/P=2.001/0.045、2.712/0.007)。结论血清Clusterin、KLK1对老年AHF病情及预后具有良好的评估价值。

不同治疗方法对冠心病患者心率变异性血清KLK1 TIMP-1水平及近期预后的影响研究

目的:探究国产雷帕霉素药物洗脱支架和紫杉醇药物洗脱球囊对冠心病患者心率变异性、血清激肽释放酶1(KLK1)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)水平及近期预后的影响。方法:回顾2019年11月至2021年5月间在我院接受经皮冠状动脉介入治疗的105例冠心病患者资料,根据治疗方式不同将其分为观察组(56例,使用国产雷帕霉素药物洗脱支架)和对照组(49例,使用国产紫杉醇药物洗脱球囊)。比较两组术前、术后1周、随访1年时的心率变异性相关指标[5min内正常窦性RR间期标准差(SDNN)、5min内正常RR间期均值标准差(SDANN)、相邻NN间期之间差大于50ms数占比(pNN50)],术前、术后1周时的KLK1、TIMP-1、内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)水平,随访1年的近期预后[血管再狭窄、血管再血栓、主要心血管不良事件(MACE)]。结果:两组SDNN、SDANN、pNN50重复测量方差分析时间比较差异有统计学意义(P<0.017),均随术后时间延长呈上升趋势;两组患者手术前后血清KLK1、TIMP-1、NO及血浆ET-1水平差值绝对值比较差异有统计学意义(P<0.05),观察组变化幅度大于对照组;随访1年时,观察组血管再狭窄发生率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),两组血管再血栓发生率、MACE发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:国产雷帕霉素药物洗脱支架可有效调节冠心病患者心率变异性,对改善血清KLK1、TIMP-1水平有积极作用,有助于保护、修复患者内皮功能,降低支架内狭窄风险,获得良好近期预后。

KLKB1联合CEA、CA199水平对老年结直肠癌的诊断价值

目的探讨血浆激肽释放酶(KLK)B1在老年结直肠癌(CRC)中的表达水平及其诊断效能。方法选取老年CRC患者60例为CRC组,另选取同期老年健康体检者60名为对照组。两组均行血浆KLKB1及癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA)199的测定。以血浆KLKB1水平的中位数为临界点,将患者分为高表达组与低表达组,比较两组临床特征差异;应用受试者工作特征(ROC)曲线评价KLKB1对老年CRC的诊断效能。结果CRC组血浆KLKB1水平显著高于对照组(P<0.05)。CRC患者血浆KLKB1高表达与低表达组肿瘤大小、TNM分期、浸润深度和淋巴结转移差异显著(均P<0.05)。ROC曲线分析显示,KLKB1诊断CRC的曲线下面积(AUC)明显优于CA199,与CEA相比差异无统计学意义(P>0.05)。KLKB1联合CEA、CA199的诊断效能进一步提升(AUC=0.928,95%CI:0.866~0.967),相比单一指标差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论血浆KLKB1可作为CRC的诊断标志物,联合CEA、CA199可提高对老年CRC的诊断效能。

血清SAA4、KLKB1对TURBT治疗非肌层浸润性膀胱癌患者预后的影响

目的观察非肌层浸润膀胱癌(NMIBC)患者血清淀粉样蛋白A4(SAA4)、激肽释放酶B1(KLKB1)水平及对经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)治疗后预后的影响。方法选择2017年1月—2019年12月首都医科大学附属北京地坛医院泌尿外科接受TURBT治疗的NMIBC患者100例为NMIBC组,以同期健康体检者60例为健康对照组。酶联免疫吸附法检测NMIBC患者血清SAA4、KLKB1水平。比较不同临床病理特征NMIBC患者血清SAA4、KLKB1水平。Pearson相关分析NMIBC患者血清SAA4与KLKB1水平的相关性。Kaplan-Meier生存曲线分析(Log-Rank检验)血清SAA4与KLKB1水平对NMIBC患者无进展生存(PFS)预后的影响。Cox比例风险回归模型分析NMIBC患者PFS预后的影响因素。结果NMIBC组患者血清SAA4、KLKB1水平均高于健康对照组(t=31.508、22.825,P均<0.001),血清SAA4与KLKB1水平呈正相关(r=0.725,P<0.001)。T1期、高级别NMIBC患者中血清SAA4、KLKB1水平分别高于Ta/Tis期、低级别癌组织(t=7.244、9.255,13.718、16.681,P均<0.001)。血清SAA4高水平和低水平患者的3年PFS分别为42.86%(21/49)、74.51%(38/51),SAA4高水平组患者3年累积PFS显著低于低水平组患者(χ^(2)/P=8.275/0.004)。KLKB1高水平组和低水平组3年PFS分别为41.67%(20/48)、75.00%(39/52),KLKB1高水平组患者3年累积PFS显著低于低水平组患者(χ^(2)/P=10.420/0.001)。肿瘤分期T1期、病理分级高、SAA4高水平、KLKB1高水平是影响NMIBC患者PFS预后的独立危险因素[HR(95%CI)=1.614(1.319~2.799)、1.917(1.319~2.799)、1.839(1.228~2.753)、1.744(1.245~2.443)]。结论NMIBC患者血清SAA4、KLKB1水平升高,两者与肿瘤TNM分期及病理分级有关,是影响NMIBC患者PFS预后的独立因素。

重组人激肽释放酶-1质量标准研究

目的:建立重组人激肽释放酶-1(rhK1)的质控方法和质量标准。方法:以S2266底物显色法测定rhK1的酶活性,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,非还原型SDS-PAGE测定相关蛋白,SDS-PAGE和反相高效液相色谱法测定纯度和成品含量,平板水平等电聚焦电泳测定等电点,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按2005年版中国药典三部规定进行。结果:用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合人用重组DNA制品质量控制技术指导原则和2005年版中国药典三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于rhK1产品的常规检定。

TK-1和TIMP-1过表达对大鼠心肌梗死后心室重塑的影响

【目的】探讨重组腺病毒介导的人TK-1和TIMP-1基因过表达对大鼠心肌梗死后的左室(LV)功能、炎症因子表达的影响及其机制。【方法】通过结扎Sprague-Dawley雄性大鼠冠脉左前降支诱导心肌梗死模型。观察假手术组(10只)、生理盐水组(13只)、对照病毒组(13只)、TK-1组(13只)、TIMP-1组(13只)、联合基因组(13只)的大鼠术后的心功能参数改变、心肌梗死面积、及各组大鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、核因子-κB(NF-κB)和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的表达水平。【结果】与假手术组相比,对照病毒组大鼠的各项心功能参数(左室舒张期内径LVIDd、左室收缩期内径LVIDs、短轴缩短率FS、射血分数EF)差(P<0.01),心肌梗死面积大(P<0.01),心肌细胞凋亡指数高(P<0.01),各炎症因子(NF-κB、MIF、MMP-2、MMP-9)的表达水平上升(P<0.01)。与对照病毒组相比,单基因组或联合基因组的心功能改善明显;心肌梗死的面积明显减少;心肌细胞凋亡指数显著下降;炎症因子的表达明显下降。相比于单基因组,联合基因组各项指标改善更显著。【结论】hTK-1或hTIMP-1单基因过表达可改善大鼠心肌梗死后的心功能,抑制炎症因子表达与心肌细胞凋亡,联合基因过表达(hTK-1和hTIMP-1)呈协同效应、改善更显著,可能的机制为hTK-1或hTIMP-1均可部分抑制MIF/NF-κB/MMP-2/9炎症信号通路。

TK1和TIMP1基因共表达载体的构建及其在大鼠血管平滑肌细胞中的表达

目的构建含人组织激肽释放酶1(hTK1)和基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP1)基因的重组腺病毒载体,并观察其在大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达。方法选择相对应酶切位点,酶切含人TIMP1基因片段的原始质粒和腺病毒穿梭质粒pDC316,经连接、热激、转化等亚克隆而构建成重组穿梭质粒。之后,应用限制性内切酶BglⅡ/SalⅠ,酶切含启动子和hTIMP1基因片段,再通过回收片段以及连接、热激等步骤亚克隆至pDC316-hTK1载体中,构建含双基因(hTK1和hTIMP1)的重组病毒穿梭质粒。利用AdMax腺病毒Cre/loxP重组酶系统,将该质粒和骨架病毒质粒于293A细胞中同源重组包装产生双基因的重组腺病毒载体。采用Western blot测定在VSMCs中的表达。结果经PCR、双酶切和测序证实,重组病毒穿梭质粒pDC316-hTIMP1-EGFP和pDC316-hTK1-hTIMP1构建正确。在293A细胞里成功包装产生含双基因的重组腺病毒载体Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后,hTK1和hTIMP1蛋白呈独立高表达,表达水平呈浓度依赖性增加。结论首次成功构建并包装了含双基因(hTK1和hTIMP1)的重组腺病毒载体,目的蛋白在VSMCs中呈现独立高表达。