Pyk2激酶区基因重组杆状病毒表达载体的构建及表达

采用PT-PCR扩增Pyk2-kinase基因,定向克隆至转移载体pFastBac HTB,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,转座后利用抗性及蓝白斑筛选阳性克隆获得重组Bacmid/Pyk2-kinase;提取重组杆粒,PCR法鉴定后转染昆虫细胞Sf9包装重组杆状病毒;利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot检测表达情况。最终获得了重组杆状病毒rBac-Pyk2-kinase,实现了Pyk2-kinase在Sf9细胞中的重组表达,其相对分子质量为32 ku,IFA、SDS-PAGE和Western blot检测结果与预期一致。

CBL通过泛素化降解NCK2抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭

目的阐明Casitas B系淋巴瘤(CBL)蛋白对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响并探讨其作用机制。方法乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF7常规培养,实验分为NC组、过表达CBL组和siNC组、siCBL组,采用克隆形成法和细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、伤口愈合实验、Transwell实验检测过表达(沉默)CBL对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术和Western blot验证CBL对乳腺癌细胞周期进程、细胞周期标志物和上皮-间充质转化(EMT)的影响;罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞骨架观察CBL对细胞丝状伪足数量的影响。采用IP-质谱法筛选CBL的相互作用蛋白并确定NCK2为研究对象。实验分为CBL组、NCK2组、CBL+NCK2组,通过免疫共沉淀(IP)和免疫荧光共定位实验验证CBL与NCK2蛋白互作情况。通过环己酰亚胺追踪实验和泛素化实验检测CBL对NCK2蛋白稳定性和泛素化的影响。采用CCK-8和Transwell实验检测NCK2对CBL介导的乳腺癌细胞增殖及迁移能力的影响。结果过表达CBL组的细胞增殖、迁移、侵袭能力显著降低(P<0.05);沉默CBL组的细胞增殖、迁移、侵袭能力显著增加(P<0.01)。沉默CBL促进MCF7细胞周期G1/S转换(P<0.05)。过表达CBL下调乳腺癌细胞周期相关蛋白CDK2/4(P<0.01)、Cyclin A2/B1/D1/D3/E2(P<0.05)、EMT相关蛋白Snail、N-Cadherin、Claudin-1(P<0.05),同时上调E-Cadherin(P<0.05);沉默CBL上调乳腺癌细胞周期相关蛋白CDK2/4/6(P<0.05)、Cyclin A2/B1/D1/D3/E2(P<0.05),EMT相关蛋白Snail、Vimentin、Claudin-1(P<0.05),同时下调E-Cadherin(P<0.05)。过表达CBL使乳腺癌细胞系MDA-MB-231中丝状伪足数量减少;沉默CBL使乳腺癌细胞系MCF7中丝状伪足数量增加。NCK2与CBL相互作用。过表达CBL抑制NCK2蛋白稳定性(P<0.05),并促进其泛素降解(P<0.01)。过表达NCK2能够逆转CBL介导的乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用(P<0.01)。结论CBL可通过泛素化降解NCK2抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。