建立实时荧光定量逆转录PCR方法检测非小细胞肺癌棘皮动物微管相关蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因

目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。

间变性淋巴瘤激酶融合基因阳性肺腺癌的临床病理特征

目的探讨间变性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因阳性肺腺癌的临床病理特征，并分析其治疗方法和预后。方法回顾性分析2005-2014年首都医科大学附属北京胸科医院收治的34例ALK融合基因阳性肺腺癌手术患者的临床资料，采用Ventana全自动免疫组织化学染色系统对术后标本进行染色，检测ALK蛋白表达情况，同时应用DNA直接测序法检测肿瘤组织表皮生长因子受体（EGFR）的突变状态。结果34例ALK融合基因阳性肺腺癌患者中，男20例，女14例；中位年龄49岁。吸烟11例，不吸烟23例。临床分期为IA期5例，IB期1例，ⅡA期2例，ⅢA期16例，ⅢB期5例，Ⅳ期分4例，未明确分期1例。免疫组织化学染色显示，所有患者的肿瘤组织均表现为肿瘤细胞的细胞质内ALK蛋白强颗粒状着色。组织学表现为实体型为主伴黏蛋白分泌14例，腺泡样为主10例，乳头状为主6例，微小乳头状为主3例，胶质样腺癌1例，其中肿瘤组织伴有黏液分泌18例，伴有筛状结构10例，伴有印戒细胞6例。34例患者中，仅有1例为ALK融合基因阳性与EGFR基因突变（21 LSSSR）共存。有24例患者获得随访，中位无进展生存时间为11．0个月。结论ALK融合基因阳性的肺腺癌具有比较独特的临床病理特征，实体型为主伴黏蛋白分泌、腺泡样为主、印戒细胞和筛状结构是其较为典型的组织学形态，大多与EGFR基因突变不共存。

间变性淋巴瘤激酶融合基因阳性肺腺癌的临床病理特征

目的：探讨间变性淋巴瘤激酶（ ALK）融合基因阳性肺腺癌的临床病理特征，并分析其治疗方法和预后。方法回顾性分析2005—2014年首都医科大学附属北京胸科医院收治的34例ALK融合基因阳性肺腺癌手术患者的临床资料，采用Ventana全自动免疫组织化学染色系统对术后标本进行染色，检测ALK蛋白表达情况，同时应用DNA直接测序法检测肿瘤组织表皮生长因子受体（ EGFR）的突变状态。结果34例ALK融合基因阳性肺腺癌患者中，男20例，女14例；中位年龄49岁。吸烟11例，不吸烟23例。临床分期为ⅠA期5例，ⅠB期1例，ⅡA期2例，ⅢA期16例，ⅢB期5例，Ⅳ期分4例，未明确分期1例。免疫组织化学染色显示，所有患者的肿瘤组织均表现为肿瘤细胞的细胞质内ALK蛋白强颗粒状着色。组织学表现为实体型为主伴黏蛋白分泌14例，腺泡样为主10例，乳头状为主6例，微小乳头状为主3例，胶质样腺癌1例，其中肿瘤组织伴有黏液分泌18例，伴有筛状结构10例，伴有印戒细胞6例。34例患者中，仅有1例为ALK融合基因阳性与EGFR基因突变（21 L858R）共存。有24例患者获得随访，中位无进展生存时间为11．0个月。结论 ALK融合基因阳性的肺腺癌具有比较独特的临床病理特征，实体型为主伴黏蛋白分泌、腺泡样为主、印戒细胞和筛状结构是其较为典型的组织学形态，大多与EGFR基因突变不共存。

非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变和EML4-ALK融合基因表达的研究

目的研究广西地区非小细胞肺癌（NSCLC）表皮生长因子受体（EGFR）基因突变和棘皮动物微管相关类蛋白4与间变性淋巴瘤激酶（EML4-ALK）融合基因表达的情况。方法分别采用扩增耐突变系统（ARMS-PCR）法和实时荧光定量PCR扩增检测119例NSCLC患者EGFR基因外显子18~21的突变和9种EML4-ALK融合突变体,同时分析其与临床病理特征的关系。结果 119例NSCLC患者共检出44例EGFR基因突变,检出率为37.0%,检出7例EML4-ALK融合基因阳性表达,检出率为5.9%。其中EGFR基因突变主要见于腺癌、女性、不吸烟患者;EML4-ALK融合基因表达可能与不吸烟有关,而在性别、年龄、肿瘤病理类型、淋巴转移方面比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;EGFR基因突变与EML4-ALK融合基因不共存。结论广西地区NSCLC患者的EGFR基因突变率与EML4-ALK融合基因阳性表达率与中国其他地区总体水平接近,均具有一定临床病理特征。

全自动免疫组化仪检测ALK融合基因蛋白的应用体会

近年来,肺癌已经居于致死性恶性肿瘤的首位,以克唑替尼等分子靶向治疗药物为核心内容的个体化治疗已经成为肺癌治疗的研究热点.间变性淋巴瘤激酶融合基因（anaplastic lymphoma kinas,ALK）是继EGFR基因之后,酪氨酸激酶抑制剂的新作用靶点[1].克唑替尼作为ALK融合基因的靶向抑制剂,已经取得了令人鼓舞的临床效果[2,3],因此,对肺癌患者进行ALK融合基因的检测具有十分重要的意义.2013年9月中国国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准Ventana全自动免疫组化仪检测ALK融合基因,我科即开始使用.现将仪使用体会总结如下.

慢性阻塞性肺疾病合并非小细胞肺癌与EML4-ALK融合基因的关系

目的探究慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并非小细胞肺癌(NSCLC)与棘皮动物微管相关蛋白样4-间变淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因的关系。方法选取COPD合并NSCLC患者70例为COPD合并NSCLC组,另选取同期收治的单纯COPD患者70例为单纯COPD组,分别采集手术治疗过程中肺癌组织及COPD患者正常肺组织,采用免疫组化法分析EML4-ALK蛋白的表达,采用logistic回归分析影响COPD合并NSCLC患者发生的危险因素。结果单纯COPD组、COPD合并NSCLC组患者性别、年龄、体质指数(BMI)比较,差异无统计学意义(P>0.05);与单纯COPD组比较,COPD合并NSCLC组患者吸烟人数比例、PASP水平、EML4-ALK蛋白阳性表达率较高,FEV1、FEV1/FVC水平较低(P<0.05)。肺癌组织中EML4-ALK蛋白阳性表达与COPD合并NSCLC患者年龄、性别、肿瘤最大径、分化程度无关(P>0.05),与吸烟史、组织学类型、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05)。FEV1/FVC指标降低、吸烟、EML4-ALK蛋白阳性表达是影响COPD合并NSCLC患者发生的危险因素(OR=1.694,95%CI:1.375~2.087;OR=2.013,95%CI:1.682~2.409;OR=3.249,95%CI:2.346~4.450;P<0.05)。结论肺癌组织中EML4-ALK蛋白阳性表达率较高与COPD合并NSCLC吸烟史、组织学类型、TNM分期及淋巴结转移有关,是影响COPD合并NSCLC发生的独立危险因素。

肺癌表皮生长因子受体基因突变与间变性淋巴瘤激酶及原癌基因1-受体酪氨酸激酶基因融合突变情况与临床病理特征的关系

目的分析肺癌表皮生长因子受体(EGFR)基因突变、间变性淋巴瘤激酶(ALK)及原癌基因1-受体酪氨酸激酶(ROS1)基因融合突变情况与临床病理特征的相关性。方法选取2019年1月至2021年1月本院收治的100例肺癌患者为研究对象,采用突变扩增系统(ARMS)检测EGFR基因突变与ALK及ROS1基因融合突变表达情况,分析EGFR、ALK、ROS1基因融合突变与临床病理特征的关系。结果EGFR基因突变型61例,野生型39例,ALK基因融合阳性率10.00%,ROSI基因融合阳性率10.00%。突变型腺癌与腺鳞癌构成比均小于野生型,差异有统计学意义(P<0.05);两种分型患者年龄比较差异无统计学意义。ALK基因融合检测阳性10例,阴性患者90例,两种分型性别与年龄比较差异无统计学意义;其中阳性患者以腺鳞癌为主,阴性患者以腺癌为主,差异有统计学意义(P<0.05)。ROS1基因融合阳性与阴性患者性别比较差异有统计学意义(P<0.05);两种分型患者年龄、病理类型比较差异无统计学意义。结论肺癌患者EGFR基因突变发生率较高,且以腺癌类型患者为主,ALK与ROS1基因融合突变不常见,但能提示肺癌特点分子亚型。

神经营养因子受体酪氨酸激酶基因融合在非小细胞肺癌诊疗中的研究进展

精准的分子靶向治疗能够显著改善晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的预后,并已成为敏感驱动基因阳性晚期NSCLC的一线标准治疗。近年来,罕见基因突变的靶向治疗成为研究的热点。神经营养因子受体酪氨酸激酶(NTRK)基因融合突变在NSCLC患者中的发生率虽然不足1%,但该基因家族中任何一个基因与其他基因发生融合突变,均会导致肿瘤细胞的异常活化,从而驱动肿瘤的发生。靶向NTRK基因的药物原肌球蛋白受体激酶(TRK)抑制剂能够为NTRK阳性的多种实体瘤患者带来显著的临床获益,且安全性好。本文从NTRK基因、一代和二代TRK抑制剂的研究进展及未来可能的治疗模式进行综述。

ALK融合基因阳性的晚期非小细胞肺癌靶向治疗进展

近十年来,晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在治疗方面出现重大的模式转变。关键致癌性突变(如驱动基因突变和染色体重排)的存在,使得靶向治疗相比传统的细胞毒性化学疗法显示出更高的敏感性。2007年间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因与棘皮动物微管相关蛋白样-4(echinoderm microtubule-associated protein-4,EML4)基因融合突变首次在NSCLC患者中被发现。随后研究证实,ALK-EML4融合突变阳性的NSCLC(ALK+NSCLC)显示出对克唑替尼治疗的敏感性。随着后续一系列靶向治疗新药的研发,将ALK+NSCLC靶向治疗推向高潮。本综述回顾ALK+NSCLC的分子生物学发病机制、流行病学特征及检测方法,汇总其抑制剂的重要临床试验结果,并解读ALK+NSCLC抑制剂耐药机制及合并脑转移的最新研究进展。

转化生长因子β受体Ⅱ在EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌患者肿瘤组织中的表达及其对H3122细胞侵袭力的影响

目的探讨转化生长因子β受体Ⅱ(TGFβRⅡ)在棘皮动物微管相关蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因阳性肺腺癌患者肿瘤组织中的表达及对人EML4-ALK阳性肺腺癌细胞H3122侵袭力的影响。方法纳入EML4-ALK阳性肺腺癌患者18例,其中ⅠA期11例,ⅢA期7例,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测患者肺癌组织中TGFβRⅡmRNA的表达量。构建TGFβRⅡ沉默质粒(TGFβRⅡ-shRNA)及阴性对照(NC-shRNA)质粒,进行慢病毒包装后转染H3122细胞,并将转染TGFβRⅡ-shRNA、NC-shRNA质粒的细胞设为LV-shRNA-TGFβRⅡ-H3122组、LV-shRNA-GP-H3122组,测定两组细胞的侵袭能力。结果ⅠA期与ⅢA期肺腺癌组织的TGFβRⅡmRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0. 05)。LV-shRNA-TGFβRⅡ-H3122组通过Transwell的细胞数多于LV-shRNA-GP-H3122组(P <0. 05)。结论 TGFβRⅡmRNA在早期与中晚期EML4-ALK阳性肺腺癌组织中的表达无明显差异,但沉默TGFβRⅡ基因后EML4-ALK阳性肺腺癌细胞侵袭性明显增强。

融合蛋白AnxB1ScuPA表达质粒的构建及诱导条件优化

目的 :在大肠杆菌中高效表达融合基因 Anx B1Scu PA。方法 :利用 PCR技术扩增 Anx B1Scu PA的融合基因 ,克隆至原核表达载体 p ET- 2 8a;转化几种不同的宿主菌 (感受态细菌 BL2 1、Rosetta、BL2 1- RIL) ,利用 IPTG(终浓度为 0 .5 mmol/ L)诱导蛋白表达 ,并对表达条件进行优化 ,根据凝胶扫描定量结果确定合适的宿主菌和诱导表达条件。结果 :Anx B1Scu PA在具有稀有密码子 t RNA的宿主菌 BL2 1- RIL 表达量较其他宿主菌为高。在菌液生长至 D6 0 0 =0 .8时 ,加入诱导剂 IPTG至终浓度0 .4 m mol/ L ,诱导 0 .5 h后加入利福平至终浓度 15 0μg/ ml,可使蛋白 Anx B1Scu PA的表达量提高至菌体总蛋白的 36 %。 结论 :通过选择具有稀有密码子 t RNA的宿主菌 BL 2 1- RIL和优化诱导条件 ,使 Anx B1Scu PA在大肠杆菌中得到高效表达。

甲磺酸阿帕替尼治疗间变性淋巴瘤激酶抑制剂耐药非小细胞肺癌的疗效分析

目的:评估阿帕替尼联合化疗治疗间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)抑制剂耐药非小细胞肺癌的有效性和安全性。方法:选择我院2018年7月至2019年6月确诊的ALK抑制剂耐药的非小细胞肺癌患者,随机数字表法分组后评估阿帕替尼联合化疗治疗的疗效和毒性,并通过Kaplan-Meier方法进行生存分析。结果:本研究包括30例患者,其中15例接受阿帕替尼联合化疗治疗,另15例接受单纯化疗。所有患者进行了无进展生存期评估,其中联合组中5例患者达到部分缓解(PR),7例达到稳定疾病(SD),缓解率为33.3%,疾病控制率为80.00%,均高于化疗组;中位无进展生存期为3.23月(95%CI:1.589~4.871)。加用阿帕替尼常见不良反应为手足综合征、胃肠反应、肝损伤及高血压,药物毒性等级基本为1~2级。结论:阿帕替尼联合化疗治疗ALK耐药快速进展的非小细胞肺癌,临床效果较为确切,毒性作用和不良反应可耐受,值得在临床中进一步研究。

非小细胞肺癌患者浅表淋巴结组织中表皮生长因子受体基因和EML4-ALK融合基因的突变状态

目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）患者浅表淋巴结转移灶组织中表皮生长因子受体（EGFR）基因和棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶（EML4-ALK）融合基因的突变状态.方法 对2013年2月至2014年11月就诊于北京军区总医院40例NSCLC患者的转移灶浅表淋巴结组织使用实时荧光定量PCR（FQ-PCR）技术检测EGFR基因及EML4-ALK融合基因的表达率,并分析二者与临床特征之间的关系以及给予靶向治疗的效果.结果 淋巴结组织中EGFR基因突变率为35.0％ （14/40）,不吸烟和腺癌患者EGFR突变率分别为50.0％ （10/20）和46.7％ （14/30）;EGFR18外显子突变1例,19外显子缺失突变8例,21外显子错义突变5例.EML4-ALK融合基因的突变率为2.5％ （1/40）.NSCLC患者淋巴结中EGFR基因突变主要见于不吸烟（P＜0.05）、腺癌（P＜0.01）人群,而与患者性别、年龄、分期无明显相关性（均P ＞0.05）;靶向治疗对有基因突变者有较高的疾病控制率（93.3％）.结论 NSCLC患者浅表淋巴结中可以检测出EGFR基因和EML4-ALK融合基因,EGFR基因突变多见于腺癌和不吸烟者;EML4-ALK融合基因突变率较低.

ALK阳性并克唑替尼治疗有效肺鳞状细胞癌临床病理分析

目的观察间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因阳性肺鳞状细胞癌(SCCL)临床病理特征、临床治疗效果,探讨对肺鳞癌患者进行ALK融合基因检测的必要性。方法 Ventana全自动免疫组化染色检测l例ALK蛋白阳性肺鳞状细胞癌患者,结合临床及影像学资料,观察组织学形态和常规免疫组化染色,分析患者临床治疗及预后。结果患者女性,54岁,不吸烟,因左背部疼痛伴咳嗽、咳痰2月余就诊。胸部CT示左肺门软组织密度影,左肺上叶支气管开口狭窄。支气管镜见左肺上叶支气管开口处新生物阻塞气道。头部MRI及骨扫描均提示有远处转移。支气管活检组织病理及免疫组化诊断:鳞状细胞癌,Ventana全自动免疫组化染色ALK蛋白阳性,表皮生长因子受体呈野生型。患者经吉西他滨联合顺铂化疗2周期,疾病进展;口服克唑替尼治疗病变缩小,疗效评价疾病稳定,疾病无进展生存期达6个月。结论肺鳞状细胞癌发生ALK重排罕见,针对ALK阳性肺鳞癌患者应用克唑替尼治疗有效;肺鳞癌患者有必要进行ALK筛查,使ALK融合基因阳性肺癌患者获益于靶向治疗。

ALK阳性并克唑替尼治疗有效肺鳞状细胞癌临床病理分析

目的观察间变性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因阳性肺鳞状细胞癌（SCCL）临床病理特征、临床治疗效果，探讨对肺鳞癌患者进行ALK融合基因检测的必要性。方法Ventana全自动免疫组化染色检测1例ALK蛋白阳性肺鳞状细胞癌患者，结合临床及影像学资料，观察组织学形态和常规免疫组化染色，分析患者临床治疗及预后。结果患者女性，54岁，不吸烟，因左背部疼痛伴咳嗽、咳痰2月余就诊。胸部CT示左肺门软组织密度影，左肺上叶支气管开口狭窄。支气管镜见左肺上叶支气管开口处新生物阻塞气道。头部MRI及骨扫描均提示有远处转移。支气管活检组织病理及免疫组化诊断：鳞状细胞癌，Ventana全自动免疫组化染色ALK蛋白阳性，表皮生长因子受体呈野生型。患者经吉西他滨联合顺铂化疗2周期，疾病进展；口服克唑替尼治疗病变缩小，疗效评价疾病稳定，疾病无进展生存期达6个月。结论肺鳞状细胞癌发生ALK重排罕见，针对ALK阳性肺鳞癌患者应用克唑替尼治疗有效；肺鳞癌患者有必要进行ALK筛查，使ALK融合基因阳性肺癌患者获益于靶向治疗。

抗肺癌药物作用靶点的研究进展

肺癌是当今世界上发生率和病死率最高的恶性肿瘤。近年来,肺癌分子靶向治疗凭借其特异性好、有效性强以及不良反应小等特点发展迅速,越来越受到人们的重视。近年来肺癌研究较热的几个靶点包括B细胞淋巴瘤/白血病2、环氧合酶2、生存素、间质上皮转变因子及棘皮动物微管相关蛋白样4与间变性淋巴瘤激酶融合基因。

唾液腺乳腺样分泌癌的研究进展

唾液腺乳腺样分泌癌(MASC)是一种近年来才被描述的唾液腺肿瘤新类型,因其存在与乳腺分泌性癌类似的特异性的E-二十六变异基因6-神经营养酪氨酸受体激酶3融合基因而得名。MASC在病理形态上非完全特异,与诸多唾液腺肿瘤有重叠,所以在病理诊断中经常将其诊断为腺泡细胞癌或黏液表皮样癌等。本文就MASC的临床表现、病理特点、分子生物学特征、鉴别诊断、预后和治疗等研究进展作一综述。

Alectinib在非小细胞肺癌治疗中的研究进展

目前，分子靶向治疗在非小细胞肺癌（Non—smallcelllungcancer，NSCLC）的治疗中占据着重要地位。克唑替尼是第一代ALK酪氨酸激酶抑制剂，于加11年在美国批准上市，用于治疗ALK重排阳性的非小细胞肺癌。然而，克唑替尼仅在治疗的早期阶段有效，长期使用后由于肿瘤出现二次突变而产生耐药。近年来，Alectinib作为第二代ALK激酶抑制剂已经在日本批准上市用于治疗AM重排阳性的NSCLC患者。本文综述Alectinib在非小细胞肺癌治疗中的研究进展。

非小细胞肺癌表皮生长因子及间变性淋巴瘤激酶基因检测及临床病理特征

目的研究汉族人群中表皮生长因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变和间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因融合在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者中的阳性率及其与临床病理特征的关系。方法收集本院非小细胞肺癌临床手术患者522例,通过ARMS-PCR方法检测NSCLC标本中EGFR基因突变和ALK基因的常见基因融合变异,分析其与患者的病理学分型、性别和年龄等临床指标的相关性。结果对共522例NSCLC手术标本检测了EGFR基因突变,并同时对其中149例标本检测了ALK基因的常见基因融合变异。EGFR基因与ALK融合基因突变阳性率分别为42.91%(224/522)与7.38%(11/149)。EGFR基因突变多发生于女性和腺癌中。另外在149例同时检测了EGFR基因突变和ALK基因融合的标本中,有1例(0.67%,1/149)检测到了EGFR基因突变合并ALK基因融合的罕见驱动基因双突变。结论在汉族人群非小细胞肺癌患者中,EGFR基因突变与患者的性别及病理学分型等临床指标存在明显相关性。ALK基因融合及EGFR、ALK双突变共存型基因突变率虽然较低,但其意义不容忽视,临床医生应给予充分重视。

阿来替尼治疗ALK阳性非小细胞肺癌伴多处转移1例

肺癌是我国发病率和致死率第一的恶性肿瘤,非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%以上。间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因阳性是NSCLC的“钻石突变”,最常见的融合类型是棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4-ALK)[1]。研究显示,脑转移在20%~40%的初诊NSCLC患者中被发现,患者发生脑转移后在放化疗等多种治疗方案中预后均欠佳。