激酶锚定蛋白1抑制线粒体分裂减轻肾脏缺血再灌注损伤

目的:探讨激酶锚定蛋白1(AKAP1)在肾脏缺血再灌注损伤(IRI)中的作用及机制。方法:首先构建小鼠肾脏缺血再灌注模型,夹闭双侧肾动脉缺血28 min,再灌注24 h后采血并留取肾组织,检测血清肌酐、尿素氮、病理损伤及AKAP1表达情况,其次将小鼠肾小管上皮细胞培养至第2天进行干预,缺氧过程(H)将细胞置入1%O_(2)、5%CO_(2)、37℃三气培养箱内无糖无血清依次培养3 h,复氧(R)时更换含10%胎牛血清低糖培养基正常培养6 h。观察对照组和各缺复氧(H/R)组再复氧6 h时肾小管上细胞一般形态,最后通过转染过表达AKAP1的方式检测H/R各组ATP含量,线粒体膜电位以及线粒体Mito-Red染色情况。结果:AKAP1在肾脏缺血再灌注后表达下降(P<0.05);小鼠肾小管上皮细胞在H/R处理后出现AKAP1表达下降以及线粒体功能障碍(P<0.05);AKAP1通过线粒体动力相关蛋白1调控H/R诱导线粒体损伤(P<0.05)。结论:AKAP1可以通过抑制线粒体功能障碍减轻肾脏IRI。

lncRNA LUCAT1通过miR-199b-5p/AKAP1信号轴促进肝癌进展的机制

目的探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)肺癌相关转录物1(lung cancer associated transcript 1,LUCAT1)通过miR-199b-5p/A激酶锚定蛋白1(A-kinase anchoring protein 1,AKAP1)信号轴促进肝癌转移的机制。方法收集2020年1月至2021年10月在成都市新都区人民医院进行手术治疗的80例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者的肝癌及癌旁组织标本,采用RT-qPCR检测LUCAT1、miR-199b-5p、AKAP1 mRNA水平。将Huh7、HepG2细胞进行不同转染,pHRi-si-NC、pHRi-si-LUCAT1分别转染至Huh7、HepG2细胞,pHRi-si-LUCAT1和pHRi-anti-miR-NC、pHRi-si-LUCAT1和pHRi-anti-miR-199b-5p、pHRi-si-LUCAT1和pHRi-NC、pHRi-si-LUCAT1和pHRi-AKAP1分别共转染至Huh7、HepG2细胞。双荧光素酶报告验证LUCAT1对miR-199b-5p、miR-199b-5p对AKAP1的调控关系;EdU染色、划痕实验和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;RT-qPCR检测细胞LUCAT1、miR-199b-5p和AKAP1 mRNA水平;Western blot检测细胞Ki67、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9水平。向20只裸鼠皮下注射已转染pHRi-si-LUCAT1的Huh7细胞悬液,30 d后测定移植瘤体积、质量、LUCAT1、miR-199b-5p、AKAP1 mRNA、Ki67、MMP-2、MMP-9水平。结果①与癌旁组织相比,HCC组织LUCAT1(1.51±0.53比1.13±0.72;t=3.802,P<0.001)、AKAP1 mRNA(3.73±0.97比1.28±0.76;t=17.783,P<0.001)水平显著升高,miR-199b-5p(1.21±0.53比3.56±1.02;t=18.286,P<0.001)水平显著降低。②转染pHRi-si-LUCAT1后,miR-199b-5p水平显著升高(Huh7:3.71±0.28比1.00±0.10,t=15.787,P=0.004;HepG2:3.49±0.25比1.00±0.11,t=15.790,P=0.004),LUCAT1(Huh7:0.34±0.05比1.00±0.06,t=14.637,P=0.005;HepG2:0.41±0.06比1.00±0.07,t=11.084,P=0.008)和AKAP1 mRNA水平显著降低(Huh7:0.52±0.05比1.00±0.09,t=8.075,P=0.015;HepG2:0.55±0.06比1.00±0.13,t=5.444,P=0.032);细胞EdU阳性率、划痕愈合率和细胞侵袭数均显著降低(P均<0.05);Ki67(Huh7:0.24±0.03比0.92±0.06,t=17.558,P=0.003;HepG2:0.10±0.03比0.51±0.03,t=16.738,P=0.004)、MMP-2(Huh7:0.20±0.03比0.90±0.05,t=20.793,P=0.002;HepG2:0.05±0.02比0.21±0.02,t=9.798,P=0.010)、MMP-9(Huh7:0.25±0.04比0.75±0.05,t=13.525,P=0.005;HepG2:0.15±0.03比0.59±0.04,t=15.242,P=0.004)表达水平显著降低;共转染pHRi-si-LUCAT1和pHRi-anti-miR-199b-5p后,miR-199b-5p水平显著降低(Huh7:1.42±0.11比3.65±0.25,t=14.142,P=0.005;HepG2:1.30±0.05比3.71±0.20,t=20.248,P=0.002),LUCAT1(Huh7:0.85±0.10比0.40±0.06,t=6.683,P=0.022;HepG2:0.90±0.08比0.45±0.04,t=8.714,P=0.013)和AKAP1 mRNA水平显著升高(Huh7:0.80±0.07比0.55±0.04,t=5.371,P=0.033;HepG2:0.85±0.08比0.51±0.04,t=6.584,P=0.022);细胞EdU阳性率、划痕愈合率和细胞侵袭数均显著升高(P均<0.05);Ki67(Huh7:0.91±0.06比0.25±0.04,t=15.853,P=0.004;HepG2:0.92±0.07比0.18±0.03,t=16.830,P=0.004)、MMP-2(Huh7:0.62±0.05比0.22±0.03,t=11.882,P=0.007;HepG2:0.75±0.05比0.39±0.05,t=8.818,P=0.013)、MMP-9(Huh7:0.51±0.05比0.18±0.02,t=10.614,P=0.009;HepG2:0.89±0.06比0.34±0.04,t=13.211,P=0.006)表达水平显著升高;共转染pHRi-si-LUCAT1和pHRi-AKAP1后,miR-199b-5p水平显著降低(Huh7:1.82±0.12比3.55±0.30,t=9.274,P=0.011;HepG2:1.70±0.14比3.62±0.25,t=11.606,P=0.007),LUCAT1(Huh7:0.71±0.03比0.30±0.03,t=16.738,P=0.004;HepG2:0.75±0.05比0.35±0.04,t=10.820,P=0.008)和AKAP1 mRNA水平显著升高(Huh7:0.87±0.05比0.51±0.03,t=10.694,P=0.009;HepG2:0.90±0.09比0.54±0.04,t=6.331,P=0.024);细胞EdU阳性率、划痕愈合率和细胞侵袭数均显著升高(P均<0.05);Ki67(Huh7:0.64±0.06比0.30±0.03,t=8.779,P=0.013;HepG2:0.75±0.06比0.25±0.03,t=12.910,P=0.006)、MMP-2(Huh7:0.80±0.05比0.34±0.04,t=12.443,P=0.002;HepG2:0.84±0.08比0.40±0.03,t=8.920,P=0.012)、MMP-9(Huh7:0.76±0.05比0.23±0.04,t=14.337,P=0.005;HepG2:0.76±0.05比0.31±0.04,t=12.173,P=0.007)表达水平显著升高;③转染pHRi-si-LUCAT1后,肿瘤体积[(523.67±64.33)mm^(3)比(1542.21±201.51)mm^(3),t=8.340,P=0.014)]和质量[(0.67±0.15)g比(1.87±0.22)g,t=7.806,P=0.016)]均显著减小,LUCAT1(0.47±0.10比1.00±0.14,t=5.336,P=0.033)、AKAP1(0.12±0.03比0.51±0.05,t=11.585,P=0.007)、Ki67(2.45±0.28比5.93±0.55,t=9.766,P=0.010)、MMP-2(2.35±0.25比5.74±0.51,t=10.338,P=0.009)、MMP-9(3.55±0.34比6.42±0.84,t=5.486,P=0.032)蛋白水平均显著降低,miR-199b-5p(1.68±0.17比1.00±0.16,t=5.045,P=0.037)水平显著升高。结论LncRNA LUCAT1通过miR-199b-5p/AKAP1信号轴促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭。

AKAP1过表达腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的功能初步研究

目的利用Ad Easy腺病毒载体系统构建A激酶锚定蛋白(AKAP)1重组腺病毒载体,初步探索AKAP1在心肌细胞中的功能。方法以正常小鼠心肌细胞c DNA为模板,利用PCR获取AKAP1基因,构建腺病毒重组质粒p Ad Easy-AKAP1。用293A细胞,包装重组腺病毒Ad-AKAP1颗粒,并用荧光蛋白标记法测定其滴度。用Western blot检测重组腺病毒感染原代小鼠心肌细胞和糖尿病心肌病细胞模型后AKAP1、Caspase-3的表达情况,用流式细胞仪检测原代小鼠心肌细胞内ROS生成水平及AKAP1对高糖状态下心肌细胞凋亡的影响。结果构建了携带AKAP1基因的过表达腺病毒载体,并获得5×10^(10)pfu/ml的高滴度重组腺病毒。重组腺病毒可感染原代心肌细胞和糖尿病心肌病模型H9c2细胞并介导AKAP1过表达(P<0.05)。与阴性对照组相比,过表达AKAP1可抑制高糖高脂状态下心肌细胞内ROS的生成(P<0.05),可抑制高糖状态下心肌细胞的凋亡和Caspase-3活化(P<0.01)。结论过表达AKAP1对高糖高脂状态下的心肌细胞具有潜在保护作用,对心肌功能发挥具有重要作用。其机制可能与AKAP1抑制心肌细胞内ROS生成、抑制Caspase-3活化、抑制细胞凋亡有关。

视网膜神经节细胞中AKAP1的丢失与青光眼小鼠病情发展的相关性及机制研究

目的探究视网膜神经节细胞中A激酶锚定蛋白1(AKAP1)的丢失与青光眼小鼠病情发展的相关性及机制。方法选择无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠,通过硬膜外静脉阻塞并烧灼建立具有慢性高眼压的小鼠青光眼模型,然后按照眼压高低分为青光眼早期组(相对低眼压+造模后7 d)、青光眼中期组(相对中眼压+造模后15 d)和青光眼晚期组(相对高眼压+造模后28 d),每组6只,另选取6只正常小鼠作为对照组(造模后7 d)。手持眼压计检测各组小鼠眼内压;蛋白质印迹分析各组AKAP1的蛋白表达;苏木精-伊红染色用于分析视网膜的病理变化;CCK-8试剂盒与TUNEL分析检测细胞的活力与凋亡;免疫组织化学分析检测细胞自噬相关蛋白的表达水平;RT-PCR实时分析磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、丝苏氨酸蛋白激酶(Akt)和腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)的mRNA表达。结果与对照组相比,青光眼早期组、中期组和晚期组的AKAP1的蛋白表达、IPL和GCL厚度和细胞活力均显著降低,眼内压、细胞凋亡率、LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin水平均显著升高(P <0.05),且随着病情发展,3组青光眼小鼠的AKAP1的蛋白表达、IPL和GCL厚度和细胞活力逐渐降低,眼内压、细胞凋亡率、LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin水平均逐渐升高,组间差异均有统计学意义(P <0.05)。结论视网膜神经节细胞中AKAP1的丢失与青光眼小鼠病情发展负相关,AKAP1的低表达,抑制了PI3K/Akt/AMPK途径,促进了视网膜神经节细胞的凋亡和自噬,因此与青光眼的发病机制密切相关,有助于AKAP1针对青光眼的定向诊断和治疗。

AKAP1调控线粒体稳态及其在心血管疾病中的研究进展

线粒体是细胞的能量工厂,同时也是细胞内信号传导的枢纽,可调节细胞增殖、分化和存活。A型激酶锚定蛋白(A-kinase anchoring protein,AKAP) 1是一种支架蛋白,因其可与蛋白激酶(protein kinase,PK) A结合而得名。近年研究发现AKAP1可将多种信号蛋白以及mRNA招募至线粒体外膜,调节线粒体功能及一系列相关生理病理过程。研究报道AKAP1可参与调控心肌肥厚、心肌细胞凋亡、血管舒张等活动,提示AKAP1与心血管疾病密切相关。本文将对AKAP1及其信号复合物调控线粒体功能的分子机制进行综述,并阐述AKAP1在心血管疾病中的研究进展。

AKAP1在高原低压低氧致心肌损伤中的保护作用及机制

目的探讨A型激酶锚定蛋白1(A-kinase anchored protein1,AKAP1)在高原低压低氧环境导致心肌损伤中的保护作用及可能机制。方法于2021年1月至2022年5月,将SPF级雄性C57BL/6小鼠分为常氧野生对照(wild type,WT)组及高原低压低氧实验(hypobaric hypoxia,HH)组,各6只小鼠;HH组用动物实验低压氧舱模拟6000 m海拔持续4周构建模型。分离SD大鼠乳鼠原代心肌细胞后分为常氧对照组及低氧实验组(n=3),用三气低氧培养箱以1%氧浓度低氧24 h构建细胞模型。用蛋白质印迹法、免疫组化及实时荧光定量聚合酶链反应检测心肌组织和细胞中AKAP1蛋白及mRNA表达。心肌点注射AKAP1或对照腺病毒后将小鼠分3组(n=6):WT组、高原低压低氧过表达对照组(HH+Ad-Ctrl组)、高原低压低氧过表达实验组(HH+Ad-AKAP1组)。用无创M型超声心动机检测小鼠心脏功能,马松及天狼猩红染色检测心肌纤维化程度,麦胚凝集素检测心肌细胞肥大状况。用siRNA干涉或腺病毒上调原代心肌细胞AKAP1表达后将细胞分3组(n=3):常氧对照组,低氧干涉对照组(低氧+siCtrl组),低氧AKAP1敲低组(低氧+siAKAP1组);常氧对照组,低氧过表达对照组(低氧+Ad-Ctrl组),低氧AKAP1过表达组(低氧+Ad-AKAP1组)。用流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法及实时荧光定量聚合酶链反应检测AKAP1、凋亡相关蛋白及mRNA的表达水平,JC-1染色检测线粒体膜电位,MitoSOX检测线粒体活性氧水平。结果HH组小鼠心肌AKAP1表达低于WT组,低氧实验组细胞AKAP1表达低于常氧对照组(P<0.01)。与WT组比较,HH+Ad-Ctrl组小鼠左心室射血分数及左心室短轴缩短率降低(P<0.01),心肌纤维化及肥大程度加重(P<0.01),B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)降低,BCL-2相关X蛋白(BCL-2-associated X protein,BAX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase 9)表达升高(P<0.01)。过表达AKAP1后,与HH+Ad-Ctrl组比较,HH+Ad-AKAP1组小鼠左心室射血分数及左心室短轴缩短率升高(P<0.01),心肌纤维化及肥大程度减轻(P<0.01),BCL-2表达升高,BAX、Caspase 3、Caspase 9表达下降(P<0.01)。与常氧对照组比较,低氧+siCtrl组大鼠原代心肌细胞BCL-2表达降低,BAX、Caspase 3、Caspase 9表达升高,凋亡水平增加(P<0.01),线粒体膜电位降低,活性氧生成增加(P<0.01)。敲低AKAP1后,与低氧+siCtrl组比较,低氧+siAKAP1组细胞BCL-2表达降低,BAX、Caspase 3、Caspase 9表达升高,凋亡水平增加(P<0.01),线粒体膜电位降低,活性氧生成增加(P<0.01)。过表达AKAP1后,与低氧+Ad-Ctrl组比较,低氧+Ad-AKAP1组细胞BCL-2表达升高,BAX、Caspase 3、Caspase 9表达降低(P<0.05),凋亡水平降低(P<0.01),线粒体膜电位增强,活性氧水平降低(P<0.01)。结论高原低压低氧条件下心肌细胞AKAP1下调,可能导致线粒体膜电位降低、活性氧生成增加,引发心肌细胞凋亡,从而加重高原低压低氧心肌损伤。

AKAP1在高糖诱导的足细胞线粒体分裂中的作用

目的研究A激酶锚定蛋白（AKAP1）在高糖诱导足细胞线粒体分裂中的作用及可能的信号转导通路。方法体外培养条件永生性人足细胞，完全分化并同步化处理后进行后续实验。实验分组：（1）葡萄糖浓度分为5、15、25、35mmol／L组刺激足细胞48h；（2）高糖（35mmol／L）培养基分别刺激足细胞12、24、36、48h；（3）正常对照组（5mmol／L葡萄糖）、高渗对照组（30mmol／L甘露醇＋5mmol／L葡萄糖）、高糖组（35mmol／L葡萄糖）、高糖（35mmol／L葡萄糖）＋AKAP1siRNA组。免疫荧光染色检测足细胞中AKAP1的表达和分布，Western印迹检测足细胞中AKAP1、线粒体动力相关蛋白1（dynamin related protein1，Drp1）、P-Drp1蛋白水平。Mitotracker Red染色观察各组足细胞线粒体形态，对长度、纵横比、形状系数定量分析。流式细胞术评价足细胞凋亡水平。结果与正常组比较，高糖刺激导致足细胞凋亡增加（P〈0．05），线粒体分裂增加、纵横比及形状系数降低（均P〈0．05），AKAP1蛋白表达水平、P-Drp1／Drp1以时间、浓度依赖方式增加（P〈0．05）；与高糖组比较，AKAP1siRNA转染后线粒体分裂减少，线粒体纵横比及形状系数升高（均P〈0．05），足细胞凋亡减少；AKAP1蛋白水平及P-Drp1／Drp1下降（P〈0．05）；上述各项高渗对照组与正常对照组差异均无统计学意义（均P〉0．05）。结论高糖刺激下AKAP1可能通过线粒体Drp1调控足细胞线粒体分裂，导致足细胞损伤。

AKAP1在肾透明细胞癌中的表达及对细胞生存的影响

目的探讨线粒体外膜蛋白A激酶锚定蛋白1(AKAP1)在肾透明细胞癌(KIRC)中的表达变化及对患者预后和细胞生存的影响。方法利用GEO、TCGA和HPA数据库,分析AKAP1在KIRC组织中的表达变化;利用RT-PCR和Western blot检测8对KIRC组织及其配对癌旁组织中AKAP1 mRNA和蛋白的表达;利用LinkedOmics和GEPIA数据库,分析AKAP1表达与KIRC患者临床病理参数的相关性及对预后的影响;Western blot检测AKAP1过表达后细胞增殖、凋亡相关蛋白表达情况;MTS和流式细胞术检测AKAP1过表达后,KIRC细胞增殖、凋亡情况。结果与癌旁组织比较,AKAP1 mRNA和蛋白表达在KIRC组织中均显著降低,且表达水平与患者病理分级及TNM分期呈负相关(P<0.05);生存分析表明,AKAP1低表达与KIRC患者不良预后相关(P<0.01)。在786-O细胞中过表达AKAP1可显著抑制细胞增殖、促进细胞凋亡(P<0.01)。结论AKAP1在KIRC组织中表达显著降低,可作为KIRC治疗的潜在靶点及预后生物标志物。