灌注脱细胞系统制备全膀胱脱细胞基质并联合脂肪干细胞构建组织工程膀胱的研究

目的应用自行设计的灌注脱细胞系统制备全膀胱脱细胞基质(BAM),并探讨采用脂肪干细胞(ADSCs)构建组织工程膀胱的可行性。方法本研究于2020年10月至2021年4月进行。采用自行设计的膀胱灌注脱细胞系统,按照灌注液流动方向和不同脱细胞液作用时间的不同,制订4种不同的脱细胞方案(分别为A、B、C、D组)。其中A组和B组均以膀胱组织的尿道口作为灌注液的流出道,C组和D组剪去膀胱顶部部分组织以膀胱顶部开口作为灌注液的流出道。A组和C组采用1%Triton X-100作用6 h,1%十二烷基硫酸钠(SDS)作用2 h;B组和D组采用1%Triton X-100作用7 h,1%SDS作用1 h。另设正常膀胱组作为对照,其组织为直接取材的天然膀胱组织,不需要灌注和冷冻保存。通过HE、DAPI、Masson三色染色和阿尔新蓝染色,以及试剂盒定量分析以筛选出快速且高效的脱细胞方案,制备全膀胱支架。以制备的BAM为支架材料,ADSCs为种子细胞构建组织工程膀胱,HE和DAPI染色观察ADSCs在BAM上的分布情况。结果HE和DAPI染色结果显示C组未见明显的细胞核残留,Masson三色染色和阿尔新蓝染色结果表明C组的胶原结构和糖胺聚糖得到较好保留。C组膀胱壁厚度与正常膀胱组[(975.44±158.62)μm与(1064.49±168.52)μm]差异无统计学意义(P>0.05)。C组DNA含量[(43.59±4.59)ng/mg]明显低于正常膀胱组、A组、B组和D组[分别为(532.50±26.69)、(135.17±6.99)、(182.49±13.69)、(84.00±4.38)ng/mg],差异均有统计学意义(P<0.05)。C组胶原含量[(10.98±0.29)μg/mg]和糖胺聚糖含量[(2.30±0.18)μg/mg]与正常膀胱组[(11.69±0.49)μg/mg和(2.36±0.09)μg/mg]比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜检查结果显示A~D组制备的BAM表面可见大量的孔隙结构,利于细胞黏附。分离培养ADSCs,流式细胞术鉴定证实CD90和CD29阳性表达,CD45和CD106阴性表达。活/死细胞双染色法和CCK-8检测证实C组制备的BAM无细胞毒性。以C组BAM为支架材料构建组织工程膀胱,HE和DAPI染色可见大量ADSCs分布于组织工程膀胱的表面和内部。结论采用自行设计的灌注脱细胞系统制备的全膀胱形态BAM可作为膀胱组织工程的支架材料,构建的组织工程膀胱可用于膀胱修复重建,为进一步临床转化研究提供实验基础。