火木层孔菌桑黄醇提物的HPLC指纹图谱研究

目的：建立10批不同产地火木层孔菌桑黄醇提物（EEPI）的HPLC指纹图谱,并对其质量进行评价。方法：采用SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,以0.2%磷酸水溶液-甲醇进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长为395 nm。以Inoscavin A为参比峰建立EEPI特征吸收峰共有模式,并通过峰重叠率计算、相似度评价系统、聚类分析等对其相似度进行评价。结果：在选定的色谱条件下,得到10批不同产地火木层孔菌桑黄指纹图谱,标定了9个共有峰,并建立了火木层孔菌桑黄的指纹图谱共有模式,相似度在0.652~0.995之间,聚类分析结果将10批火木层孔菌桑黄分为3个大类。结论：此方法简单、准确、重复性好,峰分离度较好,为有效地评价火木层孔菌桑黄的综合质量提供了参考依据。

火木层孔菌菌丝生长最适条件研究

对火木层菌丝培养的最适碳源、氮源、C/N,pH、温度等进行了研究.结果表明,火木层孔菌菌丝生长的最适碳源,氮源,C/N,pH值,温度分别是是果糖,酵母粉,20∶1,6.9,30℃.此条件下,菌丝生长旺盛且不易老化.

火木层孔菌的脂溶性成分

采用硅胶柱层析法进行分离纯化,从火木层孔菌(Phellinus igniarius)子实体的石油醚提取物和氯仿提取物中得到6种化合物。根据波谱数据,化合物1-6结构分别被鉴定为:9,12-十八烷二烯酸甲酯、3-酮-环菠萝蜜烷、麦角甾-4,6,8,22-四烯-3-酮、麦角甾醇过氧化物、麦角甾-7,22-二烯-3-酮和啤酒甾醇。其中3-酮-环菠萝蜜烷和麦角甾-7,22-二烯-3-酮为首次从火木层孔菌子实体中分离得到。

火木层孔菌桑黄对MPP^+诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响

目的评价火木层孔菌桑黄的水提物对MPP^+诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法采用PI染色分析细胞凋亡率,DAPI染色观察细胞核的形态变化,JC-1染色检测线粒体膜电位的变化,C-DCDHF-DA染色观察ROS生成的变化。结果 MPP^+诱导后SH-SY5Y细胞凋亡率明显升高,线粒体膜电位明显下降,ROS生成明显升高;火木层孔菌桑黄作用后能明显降低细胞凋亡率,其中20、10μg·mL^(-1)剂量组与MPP^+组比较具有显著性差异;其对细胞凋亡后细胞核的形态变化具有一定的改善作用;其可以提升线粒体膜电位,其中20、10、5、2.5μg·mL^(-1)剂量组与MPP^+组比较具有显著性差异;其对ROS生成具有明显的抑制作用,其中20、10、5μg·mL^(-1)剂量组与MPP^+组比较具有显著性差异。结论火木层孔菌桑黄水提物对MPP^+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有明显的抑制作用。

内生真菌诱导子对火木层孔菌次级代谢的影响

目的研究桑黄内生真菌作为生物诱导子诱导桑黄的基原菌种火木层孔菌菌株,改变火木层孔菌原有次级代谢产物。方法通过组织块法和反复划线法分离纯化野生桑黄子实体中的内生真菌。将所得内生真菌作为生物诱导子用于调控火木层孔菌的次级代谢,利用HPLC-DAD和HPLC-MS对次级代谢产物进行分析。结果共纯化得到12株内生真菌,其中4株真菌对火木层孔菌诱导调控效果较明显,尤其是菌株SHM-2诱导火木层孔菌代谢产生对卵巢癌细胞(A2708)和人结直肠癌细胞(HCT-8)有细胞毒活性和抗氧化作用的phelligridin G。结论利用内生真菌作为生物诱导子调控改变药用真菌火木层孔菌次级代谢活性成分的方法是可行的,为深入研究调控后代谢产物的差异以及寻找野生桑黄可替代资源奠定理论基础。

紫外诱导对火木层孔菌次级代谢的影响

目的通过诱导改变火木层孔菌的次级代谢产物,考察次级代谢产物中是否有桑黄素类成分产生。方法通过紫外照射火木层孔菌,挑取致死率在95%以上的优势菌株进行液体发酵培养,以桑黄素Ⅰ和二聚桑黄素A作为对照,通过HPLC-DAD和HPLC-MS/MS检测代谢产物。结果发现利用紫外照射火木层孔菌进行诱导23 min时,达到火木层孔菌95%的致死率,从中挑取优势诱导菌株8株,对这8株菌株的液体发酵次级代谢进行分析,发现UV23-7能够产生含量和数量有所增加的桑黄素类成分。结论利用紫外诱导方法改变火木层孔菌的次级代谢这一方法可行。

亚硝酸诱变对火木层孔菌的影响

目的对火木层孔菌进行诱导改造以提高该种菌的多糖和黄酮等次级代谢产物含量。方法采用亚硝酸诱变方法对火木层孔菌菌株进行诱变处理,研究两种诱变浓度下亚硝酸的诱变时间与火木层孔菌致死率的关系,比较火木层孔菌与0.005mol·L^(-1)亚硝酸诱变后代表菌株PNCM5-1的代谢产物在多糖含量和黄酮含量方面的差异。结果以诱变菌株的稳定性和代谢产物颜色变化为考察指标,确定浓度0.005mol·L^(-1)与0.250mol·L^(-1)亚硝酸的最佳诱变时间分别为60和8min。优势菌株PNCM5-1比原始菌株先到达次级代谢过程,黄酮类化合物的产量在培养12d之前均高于原始菌株。结论通过亚硝酸诱变,菌株的代谢受到调控作用,诱导菌株优先到达次级代谢过程,为桑黄生产黄酮类化合物节省培养时间,为药用桑黄活性成分的进一步开发与利用提供基础。

火木层孔菌液体培养物的化学成分研究

目的： 研究针层孔属火木层孔菌Phellinus igniarius液体培养物的化学成分并对其在多种体外药理模型上进行随机活性筛选。 方法 ：分别对发酵液及菌丝体的化学成分进行研究,采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱以及反相HPLC柱色谱等分离方法进行分离纯化;运用光谱数据解析鉴定化合物结构;在细胞水平模型上, 筛选化合物在肿瘤细胞毒、神经保护、肝保护、抗炎和抗HIV等方面的活性。 结果 ：从发酵液和菌丝体2部分共分离鉴定了29个化合物,分别为3个倍半萜：3S,9R,10S-3-羟基-11,12-O-异丙基血苋烷烯（ 1 ）,3S,9R,10S-3,11,12-三羟基血苋烷烯（ 2 ）和3S,4S,9R,10S-11,12,14-三羟基血苋烷烯（ 3 ）;3个甾体：24R-麦角甾-4,6,8（ 14 ）,22-四烯-3-酮（ 4 ）,豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇（ 5 ）和麦角甾5α,8α-过氧-6,22-二烯-3β-醇（ 6 ）;14个环二肽：环（L-脯氨酸-L-缬氨酸）（ 7 ）,环（L-亮氨酸-D-脯氨酸）（ 8 ）,环（L-亮氨酸-L-脯氨酸）（ 9 ）,环（异亮氨酸-脯氨酸）（ 10 ）,环（甘氨酸-亮氨酸）（ 11 ）,环（苯丙氨酸-丝氨酸）（ 12 ）,环（丙氨酸-脯氨酸）（ 13 ）,环（丙氨酸-苯丙氨酸）（ 14 ）,环（4-羟基-脯氨酸-苯丙氨酸）（ 15 ）,环（L-苯丙氨酸-D-脯氨酸）（ 16 ）,环（D-苯丙氨酸-D-脯氨酸）（ 17 ）,环（6-羟基-脯氨酸-苯丙氨酸）（ 18 ）,环（谷氨酰氨-脯氨酸）（ 19 ）和环（天冬氨酸-亮氨酸）（ 20 ）;9个其他类化合物：乙酰氨基苯丙氨酸（ 21 ）、腺苷（ 22 ）、苯乙二醇（ 23 ）、邻-羟基苯乙醇（ 24 ）、苯甲酸（ 25 ）、对-甲氧基苯甲酸（ 26 ）、间-甲氧基苯甲酸（ 27 ）、十六烷酸（ 28 ）和3-吡啶羧酸（ 29 ）。化合物 5和8 在1×10-5 mol·L-1时能够有效地抑制MPP＋诱导的PC12-syn细胞损伤,相对保护率分别为90.3%和87.5%,与模型组比较有显著性差异（P〈0.05）。在1×10-5 mol·L-1浓度下,化合物 12和18 可较好地保护DL-半乳糖胺诱导的WB-F344细胞损伤,细胞成活率分别为25%和24%（双环醇作为对照,细胞成活率为24%）。 结论 ：化合物 1~29 均为首次从针层孔属火木层孔菌液体培养物中分离鉴定;化合物 5和8 有神经细胞保护活性,化合物 12和18 具有肝细胞损伤保护活性,其他化合物在测试浓度下在以上筛选模型中未显示明确活性。

火木层孔菌发酵菌粉及其组分对小鼠移植性肝癌H22的体内生长作用

采用肝癌H22荷瘤小鼠的肿瘤模型,对火木层孔菌(桑黄)Phellinus igniarius发酵菌粉及其各提取物组分的体内抗肿瘤活性进行评价。结果表明,火木层孔菌发酵菌粉及其各提取物组分对荷瘤小鼠肝癌H22都具有一定的抗肿瘤作用并能延长荷瘤小鼠生存期,其中,火木层孔菌发酵菌粉(1,000mg/kg/d)及其组分I(I多糖组分)(360mg/kg/d)具有较为显著的抗肿瘤作用,抑瘤率分别为33.5%和40.3%。组织病理学研究结果表明在菌粉及其多糖组分作用后,肿瘤细胞坏死细胞明显增多,免疫组化检测表明火木层孔菌发酵菌粉及其多糖组分能明显的降低瘤组织中Bcl-2基因蛋白的表达,提高小鼠瘤组织中的Bax基因蛋白的表达。火木层孔菌发酵菌粉及其多糖组分具有较好的体内抗肿瘤活性。

火木层孔菌菌丝体胞内色素提取与抗氧化活性初探

火木层孔菌在中国传统上被称为桑黄,具有较强的抗癌等生理活性。在单因素实验的基础上,通过正交实验优化了火木层孔菌菌丝体胞内色素的提取工艺,并测定了粗提色素的抗氧化活性。结果表明,影响色素提取效果的因素主要是料液比,碱液提取的最佳条件为料液比1∶100、提取温度95℃、NaOH浓度2.5mol/L、提取时间75min,粗提色素得率较高(1.73%),并具有较强的抗氧化活性(对氧自由基的抑制率为91.68%)。该研究为桑黄真菌的综合开发应用提供了理论支持。

硫酸二乙酯诱变对火木层孔菌生长特性及色素代谢物的影响

采用硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)诱变方法对火木层孔菌菌株进行诱变处理,研究了0.5%诱变浓度下DES诱变时间与火木层孔菌致死率的关系。对筛选的优势菌株菌丝生长速度、液体发酵菌丝体生物量、菌丝形态、色素类次级代谢产物分泌以及次级代谢产物抗氧化活性方面的差异进行研究。研究表明,硫酸二乙酯诱变可改变菌丝形态但对菌丝体生长并未产生明显影响,且硫酸二乙酯诱变筛选可改善药用火木层孔菌活性成分,提高对缺氧/糖PC12神经细胞的抗氧化活性。

药用真菌针层孔菌的研究进展

目的综述近30年药用真菌针层孔菌在菌丝培养、化学成分、药理作用等方面的研究进展。方法查阅近30年国内外有关针层孔菌的研究文献,并进行分析、总结。结果已有学者对针层孔菌的菌丝培养、化学成分和药理活性等方面进行了一系列的研究,发现该真菌含有多种化学成分,且具有抗肿瘤、保护肝脏等多种药理活性。结论针层孔菌是一种极具研究和开发价值的药用真菌,应在生物学特性、人工栽培、化学、药理等方面进一步研究。

药用真菌桑黄种类研究

桑黄作为著名传统药用真菌在中国已经有2000多年的历史,但是这个真菌种类曾经被误认为裂蹄纤孔菌和鲍姆纤孔菌多年,直到2012年才发现该种实际应为一个新种,即桑黄纤孔菌(简称桑黄)。目前中国有桑黄类群的种类7种,但只有生长在桑树树木上的多年生、木栓质的纤孔菌才是真正的桑黄,本文提供了这7个种的主要特性和生境照片。在热带美洲有裂蹄纤孔菌类群5个种,这5个种和亚洲的种类不重复。火木层孔菌类群作为另外一个类群的药用真菌也曾经广泛被报道为所谓的"桑黄",但是该类群的种类具有无色的担孢子,而桑黄类群的担孢子为黄褐色。另外这2个类群在系统发育上不相关。本文也提供了美洲裂蹄纤孔菌类群和中国火木层孔菌类群种类的生境照片。此外,基于ITS序列对中国桑黄类群和中国火木层孔菌类群所有种类的系统发育进行了分析。

不同“桑黄”类真菌水提取物的抗肿瘤活性研究

用H22荷瘤小鼠对6种"桑黄"类真菌的水提取物进行了抗肿瘤活性研究。结果表明,除鲍姆木层孔菌水提取物低剂量组外,粗毛纤孔菌、椭圆嗜蓝孢孔菌、山野木层孔菌的水提取物高、低剂量组以及火木层孔菌、鲍姆木孔菌、瓦尼木层孔菌的水提取物高剂量组均具有显著抑瘤作用,抑瘤率均大于40%,其中;椭圆嗜蓝孢孔菌水提取物高剂量组(1 000 mg/kg)的抑瘤效果最佳。与阳性组和生理盐水组相比,粗毛纤孔菌高剂量组小鼠的胸腺指数均有极显著性差异(P<0.01),其余各组小鼠胸腺指数无显著性差异。6种"桑黄"类真菌水提取物均对提高小鼠肿瘤细胞中Bax的表达起到了促进作用;对Bcl-2的表达起到了抑制作用。

四种野生层孔菌的氨基酸和多糖的对比分析

火木层孔菌(Phellinus igniarius),多瘤木层孔菌(Phellinus tuberculosus),木蹄层孔菌(Fomes fomentarius),红缘拟层孔菌(Formitopsis pinicola)属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)真菌。

桑黄化学成分研究

火木层孔菌Phellinus igniarius(DC.ex Fr.)Quel又名桑黄,属于木层孔菌属(针层孔属)真菌.该真菌寄生于杨、桦、栎树等树干上,在我国东北、华北、西北及西南等地区均有分布.作为药用真菌的一种,桑黄在我国传统医药中主要用于治疗血淋、脐腹涩痛、脱肛泻血不止、妇人劳损及瘰疬溃烂等症[1].有关桑黄成分的前期研究表明该真菌中含有黑色素(melanin)[2]、甾体和萜类成分,包括麦角甾醇、芳樟醇和三萜酸,以及脂肪酸类、落叶松蕈酸和芳香酸等.本实验对桑黄95%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部分进行了较系统的化学成分研究,从中分离得到8个化合物,并通过1D、2D、NMR、IR和MS方法鉴定了结构,分别为6-(3,4-二羟苯基)-3,5-己二烯-2-酮(Ⅰ)、4-(3,4-二羟苯基)-3-丁烯-2-酮(Ⅱ)、原儿茶醛(Ⅲ)、丁香酸(Ⅳ)、原儿茶酸(Ⅴ)、咖啡酸(Ⅵ)、异麦角甾酮(Ⅶ)和阿魏酸二十八醇酯(Ⅷ).除化合物Ⅶ外,其余化合物均为首次从针层孔属真菌中发现.

四种多孔菌子实体粗多糖抗肿瘤活性的比较研究

对粗毛纤孔菌、椭圆嗜蓝孢孔菌、火木层孔菌、木蹄层孔菌4种多孔菌子实体粗多糖成分的含量及其体内抗肿瘤活性进行了比较研究。结果表明粗毛纤孔菌子实体中的粗多糖含量为4.1%,高于其他3种多孔菌;同时,4种多孔菌子实体粗多糖对H22荷瘤小鼠均显示出一定的抗肿瘤活性,除木蹄层孔菌外,其他3种多孔菌给药剂量为500mg/mL和1 000mg/mL时抑瘤率均大于40%,其中粗毛纤孔菌子实体粗多糖抑瘤率最高,低剂量组(500mg/kg)为58.12%,高剂量组(1 000mg/kg)为47.75%。

两种桑黄发酵产物的抗肿瘤活性对比

选用H22荷瘤小鼠对火木层孔菌(Phellinus igniarius)和瓦尼木层孔菌(Phellinus vaninii)发酵产物进行抗肿瘤体内试验,测定其对H22荷瘤小鼠抑瘤率、免疫器官指数、免疫因子含量和生存率的影响。结果表明,火木层孔菌和瓦尼木层孔菌发酵产物高、低剂量组(1 000 mg/kg、500 mg/kg)均对肿瘤具有一定抑制作用,其中瓦尼木层孔菌发酵产物低剂量组(500 mg/kg)抑瘤效果最佳,其抑瘤率为58.7%。火木层孔菌和瓦尼木层孔菌发酵产物高、低剂量组均可提高小鼠血清中白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)的含量、延长小鼠的生存期,但是对血清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-,αTNF-α)含量的影响作用不显著。

不同品种桑黄抗氧化和抗炎的药理作用比较

目的评价桑黄的不同品种火木层孔菌和裂蹄木层孔菌的水提物和醇提物的抗氧化和抗炎作用。方法采用亚铁还原能力(FRAP)和二苯基苦酰肼基(DPPH)自由基清除能力法观察火木层孔菌和裂蹄木层孔菌的的抗氧化作用;采用LPS诱导NO释放法观察火木层孔菌和裂蹄木层孔菌的抗炎作用。结果火木层孔菌和裂蹄木层孔菌水提物的抗氧化能力分别为(374.06±2.29)μmol TEAC·g-1提取物和(355.40±2.18)μmol TEAC·g-1提取物;醇提物的抗氧化能力分别为(408.82±6.91)μmol TEAC·g-1提取物和(414.69±2.58)μmol TEAC·g-1提取物;火木层孔菌和裂蹄木层孔菌均具有明显的清除DPPH自由基的作用,其水提物的IC50分别为7.58 mg·mL^(-1)和8.04 mg·mL^(-1);醇提物的IC50分别为5.32 mg·mL^(-1)和5.15 mg·mL^(-1);火木层孔菌水提物和醇提物作用后,对NO释放量和细胞存活率具有明显的降低作用,其中100、50、25μg·mL^(-1)剂量组与LPS组比较具有显著性差异(P<0.01或P<0.05);裂蹄木层孔菌水提物作用后,对NO释放量和细胞存活率具有明显的降低作用,其中水提物100、50、25、12.5μg·mL^(-1)剂量组与LPS组比较具有显著性差异(P<0.01),醇提物对NO释放量具有明显的降低作用,对细胞存活率具有明显的升高作用,其中25、12.5μg·mL^(-1)剂量组与LPS组比较具有显著性差异(P<0.01)。结论桑黄的不同品种火木层孔菌和裂蹄木层孔菌的水提物和醇提物均具有抗氧化和抗炎作用。

桑黄基原物种的探讨

针对在"桑黄"研究中遇到基原物种混乱的问题,基于对大量文献进行研究和笔者的实验结果,对"桑黄"的名称以及基原物种、"桑黄"的学名及分类、"桑黄"的鉴定、"桑黄"的深层次开发等问题进行讨论。