新城疫病毒F_(48)E_9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株融合蛋白 (F)基因 170 0bp克隆到真核表达载体 pcDNA3 中 ,构建成表达F基因的载体 pc3F。然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的 3 80 0bpDNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒 (HVT)非必须片段载体 pTK2 B中 ,构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒载体 pTK3 F。经限制性内切酶酶切分析 ,F基因表达盒的插入方向与pTK2 B中TK基因转录方向一致。

火鸡疱疹病毒转移载体的质粒的构建

本试验采用以SV40早期启动子控制的大肠杆菌β—半乳糖苷酶(LacZ)基因作为报告基因,将其插入到含有火鸡疮疹病毒(HVT)糖蛋白A(gA)抗原基因的克隆片段中,构建成HVT转移载体质粒,在该转移载体质粒中,大肠杆菌LacZ基因的两端分别与两段1.4kb和1.8kb的HVT同源片段相连,克隆于pUC19质粒中,将含有LacZ基因的载体质粒与感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取的全细胞DNA共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,用含有X-gal的琼脂糖覆盖细胞单层,可见到有兰色的病毒蚀斑,这些结果表明外源性的LacZ基因已被重组到HVT DNA中,同时还证明HVT的gA基因与HVT的复制无关,可以用于外源基因的插入和表达。

火鸡疱疹病毒繁殖非必须基因重组病毒用转移载体的构建

目的 构建用于基因工程疫苗制作的火鸡疱疹病毒 (HVT)外源基因转移用载体。方法 利用PCR技术 ,从感染火鸡疱疹病毒的鸡胚成纤维细胞 (CEF)基因组中成功地扩增出火鸡疱疹病毒的繁殖非必须基因 US基因 ,将该PCR产物克隆进PGEM T载体中 ,利用末端平滑化技术和连接反应 ,把报告基因LacZ基因插入到US基因中。结果 构建出了用于制作重组HVT病毒的转移载体。结论 本研究以LacZ作为报告基因 ,成功的将其插入到US基因中 。

含Ⅰ型单纯疱疹病毒包装信号序列片段的分离及扩增子质粒双表达载体的构建

利用基因工程技术分离出含有Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV－1）包装信号序列和HSV－1基因组复制起点序列的片段，表达外源基因所必需的启动子序列以及其下游作为报告基因的lacZ基因片段，构建成质粒型HSV－1载体pHSVL。用脂质体介导的方法可将该质粒转染入经辅助病毒HSV－1tsK株超感染的Vero细胞，并将其包装成HSV－1假型病毒颗粒，可如天然病毒一样再感染传代细胞和神经细胞并在其中进行基因表达。在pHSVL的基础上，我们还构建了一种可同时表达两种外源基因的质粒型疱疹病毒载体pHLCL，即在pHSVL中插入第二个转录单位：HCMVIE启动子和其下游的荧光素酶基因（lucgene），由此获得的pHLCL病毒接种传代细胞证明它可在其中同时表达两种报告基因．本研究成功地构建了两种质粒型HSV－1载体，其独特的基因转移方式使之在神经生理、病理及神经系统疾病的基因治疗的实验研究中都具有广阔的应用前景。