甲型流感病毒H1N1型灭活病毒标准物质研究

以人工培养真实病毒为原料,研制了一种甲型流感病毒H1N1型灭活病毒标准物质。该标准物质经化学灭活及灭活效果验证后,联合多家实验室采用数字PCR定量检测方法对拷贝数浓度进行定值,对标准物质的均匀性、稳定性及不确定度进行了评估。结果显示该标准物质均匀性良好,在-80~-70℃保存条件下稳定保存5个月,标准物质最终定值结果为(1384.5±249.3)copies/μL(k=2)。该标准物质可为H1N1型甲型流感病毒检测的全过程提供计量溯源和质量控制支撑,有助于提升相关核酸检测结果的准确性和可靠性。

我国与WHO血液制品去除/灭活病毒技术方法与验证指导原则的比较研究

目的:比较我国现行《血液制品病毒去除/灭活验证指导原则》[国药监注(2002)160号]与世界卫生组织(WHO)《血液制品病毒去除/灭活验证指南》,旨在推动我国血液制品病毒风险控制与管理水平的提高及血液制品的合理应用。方法:从去除/灭活病毒方法的选择、常用去除/灭活病毒方法评价、特定的去除/灭活病毒方法验证、生产工艺去除/灭活病毒能力、去除/灭活病毒方法再验证、临床试验、输血用病毒灭活血浆和正在开发的新型病毒灭活方法等几个方面进行比较,对血浆及其制品生产工艺中病毒灭活/去除的相关方法及其验证进行研究。结果与结论:我国现行《血液制品病毒去除/灭活验证指导原则》与WHO《血液制品病毒去除/灭活验证指南》总体要求基本一致,对我国血液制品去除/灭活病毒技术方法与验证工作仍具有适用性和指导性。

SARS灭活病毒免疫兔后IgG特异抗体应答

将灭活的SARS冠状病毒抗原每隔两周多点注射免疫兔,共免疫3次,以观察SARS灭活病毒免疫兔后兔血清中IgG特异性抗体的应答变化。免疫前及第一次免疫后第8、14、21、28、35天耳静脉取血,分离血清。间接ELISA法测得血清中特异性IgG抗体持续升高,并表现出一定的剂量依赖性。第35天G1、G2、G3组血清IgG抗体滴度分别为1∶51200、1∶49600、1∶25600;中和试验测得G1组第28天血清样品中和抗体效价为1∶2560;蛋白芯片测得M、N、3CL、S1、S2、S3、S4等病毒蛋白抗原都可特异性结合抗血清中的IgG抗体,但是不同蛋白抗原结合能力有差别。因此可认为SARS灭活病毒经皮下注射免疫兔后,可诱导全身性IgG抗体应答,产生SARS冠状病毒特异性抗体。

灭活病毒诱导牙鲆传代细胞差减cDNA文库的构建及分析

以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester),正常对照细胞作为驱赶子(driver),分别提取mRNA,逆转录合成双链cDNA.经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR扩增后,取正向差减的PCR产物与T载体连接,构建抑制差减cDNA文库,随机挑取7400余个克隆,对其中4200多个克隆进行PCR扩增鉴定,发现近4000个克隆中均含有插入片段,大小在250～1000bps之间,进一步对含有插入片段的近4000个克隆进行了斑点杂交筛选,得到近668个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆.初步的结果表明所建立的差减cDNA文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因.

采用S/D法灭活病毒的新型凝血酶原复合物中试研制的初探

以冰冻血浆为原料，按100L血浆／批中试规模采用有机溶剂／表面活性剂病毒灭活法制备凝血酶原复合物，并按《中国生物制品规程》（1990版）进行全面质检，结果显示在共计16个检测项目中，凝血酶活性、无菌、安全、抗HCV、抗HIV等10项指标合格率为100％（n＝6～8），热原、外观、水分合格率均为75％（n＝8），效价回收率（％）为62.56±11.56（n＝8），磷酸三丁酯和Tween80残留量分别小于10×10－6和100×10-6（n＝8）。初步提示实验室规模所建的新型凝血酶原复合物工艺用于大批量实际生产是可行的。

亚甲蓝光化学法灭活病毒的研究——抗坏血酸对血浆凝血因子的保护作用

目的 探讨抗坏血酸对亚甲蓝光化学法处理血浆时指示病毒灭活的效果 ,以及对部分凝血因子的保护作用。方法 采用CPE法评价病毒的灭活效果 ,用Clauss法测定纤维蛋白原的含量和一期法判定FⅧ :C的凝血活性。结果 在单采人血浆中加入 1μmol·L-1亚甲蓝和 2 4 0 μmol·L-1抗坏血酸 ,再给以 4 0 0 0 0lx荧光强度照射 6 0min ,VSV滴度下降 >8lgTCID50 ·ml-1,并且纤维蛋白原和FⅧ :C的回收率分别为 83.5 5 %和 81.6 7% ,比常规亚甲蓝 /荧光光化学法显著提高 (P <0 .0 1) ,而且凝血酶原时间延长值在正常允许值范围 ,活化部分凝血酶时间延长值也接近正常允许值范围。加入抗坏血酸和色氨酸可灭活病毒 ,而甘露醇不能。结论 在亚甲蓝光化学法中 ,抗坏血酸不影响病毒的灭活 ,而且对部分凝血因子有保护作用。因此 ,抗坏血酸可以有效提高单份冷冻新鲜人血浆的质量。

铜银离子协同游离氯灭活病毒的作用部位

目的：探讨铜银离子协同氯化消毒灭活病毒的作用位点．方法：用透射电子显微镜（ＴＥＭ）观察了协同消毒前后的病毒形态，并用逆转录ＰＣＲ的方法检测协同消毒前后病毒的核酸．结果：消毒前后ｆ２的外形没有变化，ｆ２对大肠杆菌的吸附力没有改变；协同消毒后脊髓灰质炎病毒Ｉ型（ＰＶＩ）为圆形颗粒，蛋白衣壳内结构被破坏；ＲＴ－ＰＣＲ检测显示协同消毒前ＰＶＩ的特异条带为阳性，协同消毒后的为阴性．结论：结果提示铜银离子协同氯化消毒灭活水中病毒的作用位点可能在病毒的核酸．

经S/D灭活病毒处理的高纯度凝血因子Ⅸ研制初探

凝血因子Ⅸ（ＦⅨ）制品是治疗乙型血友病的主要制剂，但一般方法制备的ＦⅨ浓缩物，如凝血酶原复合物（ＰＣＣ），因含有较多的其他凝血因子（凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ｘ以及蛋白Ｃ等），易导致血栓的形成。若制品未经有效病毒灭活，还可造成患者输用后感染病毒。这两种情况又因...

过敏原检测的光化学灭活病毒液态质控物的制备及稳定性观察

目的制备过敏原检测光化学灭活病毒液体质控物。方法收集外观清晰、无溶血的标本每次测试完后剩余的新鲜血清，用复合保护剂及光化学灭活病毒法制备过敏原检测的液体质控物并观察其稳定性。结果用复合保护剂及光化学灭活病毒法制备过敏原检测的液体质控物与人血清的性状相近，不需复溶，储存时间长，在4～8℃及-20℃的条件下至少可达85周。结论该液体质控物不需复溶，且稳定时间长。

九孔鲍接种灭活病毒的免疫效果分析

通过注射灭活病毒,研究接种免疫对九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)非特异性免疫机能和免疫保护效果的影响.试验结果表明:九孔鲍接种灭活病毒7 d后,体液抗菌活力、溶菌活力和酚氧化酶活性都有显著提高(P<0.01);35 d后体液抗菌活力和酚氧化酶活性回落至本底水平,与对照组差异不明显(P>0.05),溶菌活力则仍然高于对照组水平(P<0.01).注射灭活病毒A的免疫效果好于灭活病毒B,九孔鲍接受灭活病毒后引起的免疫应答强度、产生的非特异性抗感染免疫能力和特异性抗感染免疫保护效果都是前者高于后者,且免疫35 d后九孔鲍获得的抗特异性病毒感染免疫保护率,灭活病毒A为30%、灭活病毒B为20%.

口蹄疫灭活病毒配合枯草芽胞杆菌鼻腔免疫增强牛呼吸道黏膜免疫应答

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)主要通过呼吸道传播,切断呼吸道传播途径能有效的防御口蹄疫。本研究应用O型口蹄疫灭活病毒配合枯草芽胞杆菌通过喷鼻气雾免疫牛来探讨对牛呼吸道黏膜免疫应答及系统免疫应答的影响。结果显示,免疫后牛鼻黏膜与肺内支气管黏膜中的IgA分泌细胞的数量极显著增多(P<0.01),而常规口蹄疫灭活苗对IgA分泌细胞数量的影响不大(P>0.05);同时,ELISA结果显示鼻、气管、肺和肺内支气管中IL-12、TNF-α水平均极显著增加(P<0.01),尤其是在气管和肺内支气管中最为明显,但IL-6无明显差异(P>0.05)。从免疫第3天开始牛鼻液、唾液中口蹄疫特异性抗体SIgA以及血清中O型口蹄疫病毒特异性抗体均显著增加(P<0.01或P<0.05),且维持至3个月。本研究结果表明O型口蹄疫灭活病毒配合枯草芽胞杆菌喷鼻后可刺激牛呼吸道局部体液免疫和细胞免疫,同时还可诱导全身系统免疫应答,本研究为口蹄疫灭活病毒鼻腔免疫提供理论基础和应用前景。

口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌对提高牛呼吸道先天免疫力的研究

本研究采用O型口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌喷鼻气雾免疫健康牛,并设单独使用枯草芽孢杆菌组、灭活病毒、常规疫苗免疫组和空白对照组,评价O型口蹄疫灭活病毒配合免疫增强剂枯草芽孢杆菌通过喷鼻气雾免疫健康牛对其呼吸道先天免疫力的影响。通过免疫组织化学染色显示,免疫后灭活病毒配合免疫增强剂试验组牛鼻黏膜与肺内支气管黏膜中TLR7的表达和CD3^+淋巴细胞呈极显著增多(p<0.01);而常规口蹄疫灭活苗对其TLR7的表达和CD3^+淋巴细胞数量的影响不显著(p>0.05)。ELISA检测结果显示,与对照组相比,灭活病毒配合免疫增强剂试验组牛呼吸道组织中IL-12水平呈极显著增加(p<0.01),IL-4和IL-10水平无明显差异(p>0.05);而常规口蹄疫灭活苗对牛呼吸道组织中IL-4、IL-10和IL-12的影响不明显(p>0.05)。表明O型口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌能够提高牛呼吸道先天免疫力。本研究为研发口蹄疫灭活病毒的鼻腔疫苗提供重要的试验数据和参考。

亚甲蓝/光化学灭活病毒方法对血浆成分的影响

亚甲蓝 /光化学法可有效地灭活血浆中的病毒。为进一步观察该法对灭活血浆中诸成分的免疫活性及生化指标的影响 ,本研究用灭活病毒的条件处理单采血浆。将含有 1μmol/L亚甲蓝的血浆置于照度为 4 0 0 0 0lux的可见光下 ,在室温条件下处理 1小时。结果表明 ,除凝血因子Ⅷ ,PT和APTT有一定程度降低外 ,其它血浆蛋白活性未见明显变化 ,血浆中的白蛋白、葡萄糖、多种无机盐含量及血浆 pH值未受影响。处理后的血浆经不同电泳及免疫化学技术分析 ,未见新的抗原产生 ,电泳迁移率与未处理组相同。结论 :亚甲蓝

亚甲蓝/光化学法灭活病毒对血浆成分的影响

背景:对血液进行病毒灭活是保障安全输血的措施之一,亚甲蓝/光化学法灭活人血浆中病毒的效果已被证实,但其对血浆成分影响的报道很少。目的:观察亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆对血液成分结构和功能的影响。方法:随机选择40份采血后6h内400mL全血制备的新鲜血浆称质量留样,然后与亚甲蓝病毒灭活过滤器无菌连接,亚甲蓝的终浓度在0.9～1.3μmol/L。将加入亚甲蓝的血浆置入4℃病毒灭活箱的搁架上,摆动频率60次/min,利用32000～38000Lx光照强度的可见光4℃照射35min,将光照后的血浆通过病毒灭活过滤器滤除亚甲蓝和残余白细胞,混匀后留样10mL,立即置于-80℃冰箱冻存。检测照射前后样品的血浆量、亚甲蓝浓度、FⅧ∶C、FⅤ∶C、VWF、Fib含量的变化。结果与结论:血浆病毒灭活后血浆容量、FⅧ∶C、FⅤ∶C、VWF、Fib的回收率分别为(96.39±1.73)%、(82.55±9.25)%、(81.03±15.27)%、(93.25±6.17)%、(81.61±14.25)%。亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒对血浆中大多数成分的影响不明显,可以满足临床安全输血的需求。

亚甲蓝光化学法灭活病毒的分子生物学机制

用模型病毒进行的基本反应机制研究表明,亚甲蓝(Methylene blue,MB)光化学法灭活病毒时形成的病毒RNA-蛋白交联是导致病毒灭活的主要损伤。此外,氧,特别是亚甲蓝被光激活后通过II型途径所产生的单线态氧,对亚甲蓝光化学法灭活病毒也起到重要作用。

纤维蛋白原制剂灭活病毒工艺的初步研究

在纤维蛋白原(简称纤原)常规生产工艺中增加“有机溶剂/表面活性剂(S/D)”灭活病毒步骤·TNBP及Tween-80浓度分别为0.3％及1％,在24℃处理6小时,能有效灭活标志病毒VSV(7.31g_(10))及Sindbis V(6.831g_(10))。残余的TNBP及Tween-80可通过两次8％乙醇沉淀去除。病毒灭活后纤原的可凝固蛋白纯度由原来的70.9±8.5％提高至85.5±6.0％,回收率可保持在64.7±3.8％。PAGE电泳显示来出现新的蛋白区带。

长链PCR技术评价^(60)Co-γ射线灭活病毒的研究

目的探讨用长链PCR技术评价60Co-γ射线辐照灭活伪狂犬病毒(pseudorabies virusPRV),后残余病毒感染性的可行性。方法针对PRV糖蛋白gD基因前后的保守区设计预计产物长短不一的5对引物,用PCR扩增经不同剂量60Co-γ射线照射后的PRV核酸,并同时以细胞感染法做平行对照。结果60Co-γ射线辐射对PRV核酸的破坏有剂量依赖性,随着60Co-γ射线剂量的增加,PRV核酸被破坏程度增加,剂量≥20kGy时完全被灭活。5条不同长度PCR扩增产物中,只有长片段3.9kb的检出与细胞培养结果一致。结论γ射线对PRV核酸的损伤程度随γ射线剂量增加而增大;用长链PCR(3.9kb)来评价经60Co-γ射线辐照灭活病毒后残余病毒的感染性是可行的。

维生素B_2作为光敏剂灭活病毒的实验研究

目的探讨维生素B2工作浓度及紫外光强度对维生素B2光化学法灭活病毒效果的影响。方法将滴度为7．25 lg TCID50的水泡性口腔炎病毒（VSV）悬液置于聚氯乙烯（PVC）血袋中，加入不同浓度维生素B2溶液结合不同强度紫外光（λ：250-350nm）照射，处理后的维生素B2和病毒悬液混合物接种于Hep-2细胞单层，测定病毒滴度，观察维生素B2光化学法对VSV的灭活效果。结果工作浓度为300μmol／L的维生素B2结合强度为1920μW／cm^2紫外光照射10min，即可将滴度为7．25 lg TCID50的VSV灭活至〈0．50 lg TCID50。结论维生素B2结合紫外光照射可以有效灭活VSV。

FFP经亚甲蓝光化学法灭活病毒并直接冻干于血袋的冻干血浆研制

目的探索制备冻干血浆的新工艺,研制适合在艰苦环境下储运和方便使用的新型冻干血浆。方法采用亚甲蓝光化学技术对新鲜冰冻血浆(FFP)做病毒灭活处理,再将FFP直接冻干于血袋中,观察不同条件下的保存效果。结果亚甲蓝光化学技术(终浓度为1μmol/L)能有效灭活血浆中的Sindbis病毒、PRV和VSV等指示病毒,处理30min后灭活效果>4.75LgTCID50,经细胞3代盲传证明灭活病毒效果可靠。新型冻干血浆外观成淡黄色疏松体,残水量为2.2%—2.5%,室温下<2min完全溶解;储存稳定性试验表明,新型冻干血浆中的FⅡ、FⅤ、FⅧ、FⅨ和FⅪ在25℃和4℃比较稳定,高温(40℃)保存对其活性有一定影响。结论采用亚甲蓝光化学灭活病毒技术和袋装血浆冻干技术制备新型冻干血浆是可行的。