纳米锌对杀鲑气单胞菌的灭活效果及其细胞毒性

为探究纳米锌在制备水产动物致病菌灭活疫苗应用中的可行性。本研究利用不同浓度的纳米锌水溶液在不同温度条件下对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)进行不同时长的孵育处理。研究显示,纳米锌对杀鲑气单胞菌的灭活效果与浓度、温度及孵育时间均呈现正相关性,在高浓度与高温条件下灭活菌体所需的时间短。检测了不同灭活条件下纳米锌对杀鲑气单胞菌菌体蛋白及免疫原性的影响,SDS-PAGE结果显示不同条件下纳米锌灭活的杀鲑气单胞菌菌体蛋白组成及丰度与正常菌体没有明显差异;而扫描电镜结果显示,在37℃条件下纳米锌会造成菌体结构破损并出现细菌碎片;ELISA检测结果4℃条件下各纳米锌浓度灭活组菌体抗原性均未受到显著性影响,然而在28℃条件下,200和400mg/L纳米锌灭活组菌体抗原性显著低于对照组,而在37℃条件下除50mg/L浓度组外,其它3个浓度灭活组抗原性均显著低于对照组。比较研究了100mg/L-28℃灭活组与甲醛灭活的全菌疫苗的免疫保护效果,结果显示纳米锌与甲醛灭活菌体免疫组鱼体的免疫保护率分别为86.2%与79.3%。利用鲤上皮瘤细胞对纳米锌的细胞毒性进行了检测,结果显示400mg/L浓度以下纳米锌对细胞的贴壁、生长及代谢均无明显影响。本研究结果说明纳米锌对杀鲑气单胞菌具有明显的灭活效果,且灭活的全菌疫苗表现出良好的免疫保护效果,而其对菌体的抑杀能力及损伤程度与温度和时间密切相关,本研究为纳米锌在水产全菌灭活疫苗的制备提供了基础。

大西洋鲑杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和致病性研究

杀鲑气单胞菌为气单胞菌属(Aeromonas)革兰阴性短杆菌,可导致鲑鳟鱼类发生疖疮病或溃疡病。患病鱼的典型症状表现为体侧或尾部形成特征性脓肿,严重时脓肿部位溃烂形成溃疡,剖检可见肝脏、脂肪组织出现点状出血[1]。已有研究表明,杀鲑气单胞菌包括多个亚种如无色亚种(Achromogenes)、杀鲑亚种(Salmonicida)、杀日本鲑亚种(Masoucida)、史氏亚种(Smith)和溶果胶亚种(Pectinolytica)等[2],

养殖大菱鲆病原菌——杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和组织病理学研究

自然发病的养殖大菱鲆幼苗出现口部周围皮下出血,肝脏灰白色并萎缩坏死的症状。从肝脏中分离纯化得到优势菌株,定名为db14。该菌株在LB培养基上生长较缓慢,早期菌落稍隆起,白色,质地较硬;人工感染试验证实对大菱鲆有较强的致病性,其半数致死剂量LD50为2.75×103cfu/g;生理生化特征测定显示其与杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.achromogenes)相似度最高;细菌16S rDNA序列测定后在GenBank中进行序列比对分析,结果与杀鲑气单胞菌无色亚种的序列同源性最高,为100%。综合上述结果,确定该菌株为杀鲑气单胞菌无色亚种。该菌株对复达欣、菌必治、丁胺卡那霉素和氯霉素等较为敏感。通过对人工感染菌株db14的大菱鲆组织切片观察,发现病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠道等器官的组织均有明显的病理变化,而心脏和脑未发现明显异常。

石鲽(Kareius bicoloratus L.)源杀鲑气单胞菌杀鲽亚种生物学性状的研究

采用分类方法,对从两起石鲽(KareiusbicoloratusL.)细菌性败血感染症病例的病(死)鱼中分离到的相应病原菌,进行形态特征、培养特征、自凝性、色素产生情况及生理生化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中(G+C)%的测定等研究。结果表明,分离菌为杀鲑气单胞菌的新亚种(subsp.nov.)并定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种(Aeromonassalmonicidasubsp.flounderacidasubsp.nov.)。经血清型检定,表明60株菌均为同种血清型。选择代表菌株做对健康石鲽、牙鲆、鲤、鲫及泥鳅的人工感染试验,表明了相应的原发病原学意义及较强的致病作用。药敏试验结果表明,对供试37种抗菌药物中的青霉素G等6种耐药,对头孢噻肟等25种高敏,对多黏菌素B、利福平2种敏感,对头孢唑啉等4种在株间存在一定敏感性差异。该研究结果能较全面地反映出该菌的主要生物学性状。

斑点叉尾源杀鲑气单胞菌无色亚种分离鉴定及药敏特性

研究从患溃疡症斑点叉尾鲙中分离到一株致病性菌株ry01,生理生化鉴定和16S rDNA基因序列分析表明ry01株为鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾鲙的半数致死量为4.17×10~6 CFU/m L。菌株ry01对强力霉素及左氧氟沙星等高度敏感,为斑点叉尾鲙该病防控提供了理论依据。

杀鲑气单胞菌一新亚种的生物学特性及系统发育学分析

从石鲽(Kareius bicoloratusL.)细菌性败血感染症的病鱼(濒死及死亡不久)中分离到相应病原菌,进行形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中G+C mol%的测定。同时,选择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定,测定16S rRNA基因序列、分析相关细菌相应序列的同源性,构建系统发生树。结果表明,分离鉴定的60株菌为杀鲑气单胞菌的一个新亚种(subsp.nov.),定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.flounderacidasubsp.nov.)。代表菌株HQ010320-1及HQ010320-5的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的杀鲑气单胞菌的同源性在99%和100%

杀鲑气单胞菌灭活疫苗的制备及免疫效果评价

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida,As)属于气单胞菌属,形态为短杆菌,革兰氏染色阴性,其在淡水与海水环境中广泛存在,之前研究认为其不能在37℃生长,是嗜冷无动力型气单胞菌,但近期的一些山羊和人类的病例表明其可能为人-畜-鱼共患病原菌。目前已发现多个亚种,即典型亚种1种(杀鲑亚种),不典型亚种4种(无色亚种、杀日本鲑亚种、产果胶亚种及史氏亚种)。

杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种胞外产物毒性及免疫原性分析

用玻璃纸平板法提取了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Aeromonassal monicida masoucida的胞外产物(ECP)。毒性试验证实,ECP对剑尾鱼Xiphophorus helleri具有致死性,其半致死量(LD50)为4.72μg蛋白/g体重。SDS-PAGE表明,ECP由13条蛋白带组成。利用大鼠抗ECP血清进行的Western-blot印迹显示,组成ECP的13条蛋白带中有7条具有免疫原性,能够引发机体的免疫应答反应产生抗体,其分子量分别为88、70、42、39、36、22和15kDa。

细鳞鱼杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离鉴定

为确定吉林省某渔场细鳞鱼发病死亡的病因,本研究由濒死的细鳞鱼体内分离出一株优势菌,经动物回归试验,该菌株对细鳞鱼具有致病性,将其命名为BRL-15。经菌体、菌落形态,理化特性,16S rRNA基因序列分析,鉴定菌株BRL-15为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。药敏试验结果显示,该菌株对所选抗菌药物中绝大多数高度敏感。试验结果为细鳞鱼杀鲑气单胞菌病的防治提供一定理论依据。

两种佐剂对细鳞鲑杀鲑气单胞菌灭活疫苗免疫效果的影响

为了探究添加弗氏佐剂和蜂胶佐剂后杀鲑气单胞菌灭活疫苗的免疫效果,分别制备含两种不同佐剂的杀鲑气单胞菌灭活疫苗,免疫细鳞鲑,并设不加佐剂组和对照组,分别于免疫后不同时间采血,检测血清抗体效价,评价相关免疫指标和免疫保护率,以期为鲑鳟鱼疥疮病的防控和珍稀水生物种保护提供技术参考。

长江上游网箱养殖圆口铜鱼杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离与鉴定（英文）

研究首次报道了圆口铜鱼(Coreius guichenoti)疥疮病,从患病圆口铜鱼的肝脏中分离到优势菌株YTL1,并运用形态学观察、生理生化检测、16S rRNA和6个管家基因的系统发育分析等对分离菌株进行鉴定。基于以上实验结果,YTL1被最终鉴定为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)。通过标准Kirby-Bauer纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验,筛选治疗该暴发病的有效药物,结果显示YTL1对氟苯尼考,诺氟沙星和氨苄青霉素等13种抗生素敏感,对6种抗生素如杆菌肽,链霉素和卡那霉素有耐药性,对红霉素具有中等敏感性。因此,氟苯尼考被建议用来伴饵投喂,并取得了较好的疾病控制效果。草鱼幼鱼(Ctenopharyngodon idella)和斑马鱼(Danio rerio)的人工感染试验结果显示,经腹腔注射7.6×106—7.6×108 CFU/mL的YTL1菌液后,感染鱼的症状与患病圆口铜鱼症状相似。研究证明基于6个管家基因的多序列位点分型是鉴定杀鲑气单胞菌至亚种水平的一种有效方法,杀鲑气单胞菌是圆口铜鱼人工养殖的最大威胁之一,并发现鲤科鱼类,如草鱼和斑马鱼均是杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的易感宿主。

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp.salmonicida)和杀日本鲑亚种(A.salmonicida subsp.masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg^(2+)浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃,10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5μL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃,10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5μL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检测方法,该检测方法为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的流行病调查和快速诊断提供了支撑。

1株杀鲑气单胞菌杀鲑亚种对甲酸乙酯的降解研究

甲酸乙酯广泛存在于化工行业的废水中,对生物体及环境都具有很大的危害。微生物降解是处理甲酸乙酯的重要方法之一。采用富集培养法和平板划线法从活性污泥中筛选出一株能降解甲酸乙酯的菌株ETH-3。经形态观察、生理生化试验和16S rDNA鉴定,确定该菌株为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)。通过摇瓶实验测定菌株ETH-3的最佳生长环境条件以及其对甲酸乙酯的降解能力,结果表明,该菌株最佳生长温度为25-30℃、最佳生长pH为8左右。该菌株具有较强降解甲酸乙酯能力,在30℃时,36 h内对0-10 500 mg/L的甲酸乙酯可达完全降解。经GC-MS对代谢产物的分析发现,甲酸乙酯会先被微生物代谢为甲酸和乙醇,后甲酸和乙醇会被微生物进一步降解为CO2和H2O。

绿鳍马面鲀与许氏平鲉杀鲑气单胞菌病原的分离和鉴定

2018年和2019年,山东省烟台市蓬莱市一养殖场工厂化养殖的绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)和许氏平鲉(Sebastes schlegeli)发病死亡,主要症状为嘴部溃疡、红肿和出血。从发病鱼内脏中均可分离到大量形态一致的优势菌,分别命名为2018TS-1和2019SS-1,分离菌株经16S rRNA测序、生理生化鉴定和vap A基因分析确定为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp. masoucida)。人工感染结果显示,2018TS-1和2019SS-1分别能引起绿鳍马面鲀和许氏平鲉的死亡,被感染鱼呈嘴部红肿症状,与自然发病症状一致,其半数致死量分别为1.78×10^(5)和0.89×10^(5) CFU/尾。本研究首次报道了国内工厂化养殖绿鳍马面鲀和许氏平鲉感染杀鲑气单胞菌的病例,是目前人工养殖绿鳍马面鲀的首个疾病报道,也是继大西洋鲑(Salmo salar)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)和裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)等品种后,在山东省海水养殖鱼类中再次发现杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的感染。本研究结果丰富了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的感染宿主范围,也为绿鳍马面鲀和许氏平鲉养殖的病害防控提供依据。

杀鲑气单胞菌疫苗的研制

以导致泥鳅腐皮病的病原菌杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)D5-7为研究对象,使用甲醛灭活菌液制取预防杀鲑气单胞菌的全灭活疫苗。经过试验,最终确定使用终体积分数为0.08%的甲醛溶液可以完全灭活杀鲑气单胞菌;将该全灭活疫苗注射入泥鳅腹腔时,未出现异常。用20 g/L的海藻酸钠制成微胶囊疫苗,以质量比1∶30混入饲料进行投喂,在免疫21 d后,进行免疫检测(血清凝集抗体效价,SOD)。结果表明:菌液在甲醛体积分数为0.08%的条件下,灭活24 h可以杀死全部菌体;相同免疫时间内,微胶囊疫苗处理后泥鳅的血清凝集抗体效价最高可达到1∶320,大于未处理对照;攻毒试验表明,微胶囊疫苗处理后相对免疫保护率可达40%。该研究结果为杀鲑气单胞菌疫苗的研制及应用提供了理论依据。

一株大菱鲆源杀鲑气单胞菌非典型株的分离鉴定及毒力基因型

为研究大菱鲆Scophthalmus maximus杀鲑气单胞菌非典型株的特性,利用常规病原菌分离方法,从某养殖场患病个体脾脏分离纯化获得一株优势菌BHAS-1,通过生理生化鉴定、序列比对、回归感染、毒力基因检测和药敏试验等对其开展研究。结果表明:分离株BHAS-1为无运动能力、β溶血的革兰氏阴性杆菌,与杀鲑气单胞菌非典型株具有相似的生理生化特性,但该分离株不产生吲哚,不能利用甘露糖;对菌株开展16S rRNA、gyrB、vapA基因扩增和序列比对,基于vapA基因构建的系统进化关系中,分离株BHAS-1与Aeromonas salmonicida subsp.masoucida RZ6S-1及ATCC 27013T单独聚为一支,结合生理生化鉴定结果,判定分离株为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种A.salmonicida subsp.masoucida;菌株BHAS-1对大菱鲆的半致死浓度(LD)为1.62×10^(8)CFU/mL,毒力基因型为aer^(+)-zot^(+)-dna^(+)-ser^(+)-lip^(+)-sp^(+)-alt^(+)-act^(+)-ast^(+)-epa^(+)-fla^(+)-ahyB^(+);菌株BHAS-1对恩诺沙星、四环素等7类13种抗生素敏感,对复方新诺明、氯霉素等6类7种抗生素耐药,耐药率为31.82%。研究表明,应用vapA基因可以有效鉴别杀鲑气单胞菌不同亚种。

细鳞鲑疖疮病的病原鉴定及防治药剂筛选

自然发病的细鳞鲑(Brachymystax Lenok)出现鳃盖边缘、鳍条基部充血,鳍条溃烂,肛门红肿等症状。从病灶处分离得到的优势菌株,定名为BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3。通过回归感染试验证明BJSY-1为致病菌,其LD50为6.97×10^5CFU/mL。经生理生化鉴定和16SrDNA序列分析最终确定BJSY-1菌株为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.Salmonicida)。该菌对四环素类、喹诺酮类等药物高度敏感。选择氟苯尼考作为治疗药物,按20mg/kg·bw的用药量拌饵投喂,每天投喂1次,连续投喂有较好的治疗效果,为杀鲑气单胞菌的治疗和防控提供了参考。

异育银鲫源杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离鉴定

【目的】分离鉴定江苏省扬州市养殖场异育银鲫患病病原。【方法】采用常规的理化特性和分子生物学的方法,对从濒死异育银鲫肝脏处分离到的菌株YZ-1进行表型生物学、分子生物学及药敏试验的系统研究。【结果】该菌株16S r RNA基因(序列长度1 446 bp,Gen Bank登录号为JX164202)与其它杀鲑气单胞菌16S r RNA基因一致性在99%-100%之间,构建发育树确定该菌株为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)。人工回感可导致异育银鲫死亡。药敏试验结果显示:对头孢呋辛、复方新诺明、恩诺沙星等23种抗生素敏感;对阿米卡星、四环素、大观霉素、头孢拉定等11种抗生素中度敏感;对青霉素G、链霉素、庆大霉素、氟苯尼考、万古霉素等10种抗生素耐药。【结论】研究结果证实引起异育银鲫死亡的病原为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。

1株乌鳢源杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离与鉴定

从自然发病的养殖乌鳢肝脏、肾脏中分离纯化得到优势菌株,定名为DSY1301。该菌株在普通营养肉汤及TSA上生长缓慢,在血平板上生长迅速。通过回归感染试验证实为致病菌,其LD50为1.896×103cfu/mL。细菌16SrDNA全序列测定后在GenBank中进行序列比对分析,结果与多种气单胞菌属的细菌同源性都高达99%,通过扩增杀鲑气单胞菌表面阵列蛋白基因VapA确认为杀鲑气单胞菌,结合梅里埃ATB Expression生化结果最终确定为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。通过药敏试验发现对氟苯尼考和氯霉素敏感。