不同种类无机盐对灰毡毛忍冬“渝蕾1号”悬浮培养体系中细胞生长和绿原酸含量的影响

为提高灰毡毛忍冬"渝蕾1号"悬浮培养体系中绿原酸的含量,该研究探讨了B_5培养基中不同浓度的无机盐对灰毡毛忍冬"渝蕾1号"悬浮培养细胞生物量及绿原酸含量的影响,通过在悬浮培养体系中添加不同浓度的无机盐,采用重量法测定灰毡毛忍冬"渝蕾1号"悬浮培养细胞的生物量及采用高效液相色谱法测定绿原酸的含量。结果表明:当硝态氮和铵态氮配比与B_5培养基中硝态氮和铵态氮配比一致时,即NO_3^-/NH_4^+摩尔比值为13∶1时,培养体系有利于细胞的生长和绿原酸的积累。当KNO_3浓度为3.5 g·L^(-1)时,细胞生物量达到最大,为19.26 g·L^(-1);当KNO_3在较低浓度(0.5 g·L^(-1)和1.5 g·L^(-1))时,积累较多的绿原酸。NO_3^-的两项研究结果均与对照浓度(2.5g·L^(-1))有一定的差异。另外,对(NH_4)_2SO_4来说,在高于对照浓度0.134 g·L^(-1),即浓度为0.268 g·L^(-1)时,生物量和绿原酸含量都达到了最大。P、Ca、Mg三种矿质元素的研究结果表明,当Na H_2PO_4·2H_2O浓度为0.10 g·L^(-1)、Ca Cl_2的浓度为0.20 g·L^(-1)时,细胞的生长和绿原酸的积累均可达到最大值;而对Mg^(2+)来说,低浓度促进细胞的生长,高浓度促进绿原酸的积累。兼顾细胞生物量和绿原酸含量两个指标,需选择适中的浓度。这些结果均与对照浓度有一定的差异。这说明灰毡毛忍冬"渝蕾1号"悬浮细胞所需无机盐的浓度与B_5培养基无机盐的浓度有一定的差异,选择适宜的浓度可促进其悬浮细胞的生长及次生代谢产物绿原酸的积累。该研究结果为绿原酸的工业化生产打下了基础。

灰毡毛忍冬MADS-box基因家族鉴定与CMB1基因克隆

目的鉴定灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides MADS-box家族基因并进行生物信息学分析与表达模式验证,克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬MADS-box家族成员CMB1全长。方法基于转录组数据,利用在线工具对灰毡毛忍冬MADS-box进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR验证MADS-box基因在不同品种中的表达模式,通过RT-PCR、RACE技术克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬CMB1基因全长。结果28个灰毡毛忍冬MADS-box蛋白长度为89~359 aa,碱性蛋白占比85.7%,不稳定蛋白占比96.4%,亲水性蛋白占比96.4%,均定位于细胞核,均为无跨膜结构的非分泌蛋白。转录组显示,与野生型比较,湘蕾型中28个MADS-box基因有17.86%表达下调,MIKCC型基因中有18.75%表达下调。克隆得到在两个品种的灰毡毛忍冬花中高度特异性表达的CMB1基因全长,均包含一个738 bp的ORF,编码245个氨基酸。CMB1基因在两个品种的花中表达量存在显著差异(P<0.01),且与茎、叶相比,在花中高度特异性表达(P<0.01)。结论基于灰毡毛忍冬转录组数据,鉴定了28个MADS-box家族基因,克隆得到湘蕾型与野生型灰毡毛忍冬CMB1基因全长,为进一步研究灰毡毛忍冬花发育、优良表型形成的分子机制提供研究基础与理论依据。

灰毡毛忍冬花器官发育相关LmSOC1基因克隆及表达分析

【目的】克隆灰毡毛忍冬MADS-box家族基因SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1),对其进行生物信息学和表达模式分析,为探究灰毡毛忍冬花冠不开放机制奠定理论基础。【方法】基于花蕾型灰毡毛忍冬转录组数据,筛选到开花调控基因LmSOC1的Unigene序列并克隆全长cDNA序列,通过生物信息学分析和实时荧光定量PCR技术分析编码蛋白特性和不同品种中LmSOC1基因的表达特异性,最后将LmSOC1基因插入到原核表达质粒载体pTOPO-D1中,并在表达宿主BL21(DE3)中进行蛋白表达。【结果】LmSOC1基因包含645bp的ORF区,LmSOC1蛋白不含信号肽、无跨膜区,为稳定的亲水性蛋白。系统进化树分析表明,LmSOC1蛋白与黄花蒿、榴莲、可可等的SOC1蛋白亲缘关系更近。实时荧光定量PCR分析表明,在2个花蕾型灰毡毛忍冬品种的花蕾和叶片中均检测到LmSOC1基因的表达,而叶片中表达量明显高于花蕾。同时,在早期花蕾中LmSOC1基因的表达量高于晚期花蕾,在‘金翠蕾’品种中这一表达差异极显著(P<0.01)。最后成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出重组蛋白。【结论】通过对LmSOC1基因的克隆和表达分析发现,该基因可能在灰毡毛忍冬花器官发育过程中发挥重要作用,为进一步研究该基因在植物花发育中的生物学功能奠定了基础。

不同外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物量生长和绿原酸含量的影响

为探索外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生长及其代谢产物绿原酸含量的影响,该研究通过在培养基中添加不同种类和浓度的外源激素,以诱导其愈伤组织的产生及增殖生长,并采用称量法和高效液相色谱法分别检测愈伤组织生物量和绿原酸含量。结果表明:不同外源激素及其组合对愈伤组织生物量和绿原酸含量的积累产生不同的影响;培养基中添加单一外源激素时,对愈伤组织生物量影响最大的为TDZ激素;和对照相比,不同浓度的TDZ均使生物量显著提高,其中0.5 mg·L-1的TDZ使生物量达最大,为0.62 g;对绿原酸积累影响的结果不太一致,除TDZ激素影响最小以外,0.5 mg·L-1的NAA使愈伤组织中的绿原酸含量积累最多,为11.18 mg·g-1;外源激素组合中,含有TDZ激素的组合生物量偏高,但绿原酸含量偏低,这与单一外源激素的结果一致。MS+0.5 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-12,4-D培养基使愈伤组织中绿原酸含量积累较多,为15.53 mg·g-1,且生物量达最高,为0.65 g,因此该激素组合为该研究最适培养基组合。通过筛选适宜的外源激素及其组合能促进灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物量的提高和次生代谢产物绿原酸的积累。研究结果对从灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织中获得大量的绿原酸提供了重要依据。

灰毡毛忍冬新品种‘渝蕾一号’的组织培养研究

目的：建立灰毡毛忍冬新品种‘渝蕾一号’Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.‘Yulei1’组培快繁体系,为实现其工厂化育苗提供理论依据。方法：以‘渝蕾一号’幼嫩茎段和叶片为外植体,以MS为基本培养基,在组织培养的不同阶段添加不同浓度的NAA、6-BA、TDZ、IBA等植物生长调节物质,对愈伤组织的诱导、增殖及分化,茎段腋芽诱导、增殖及生根炼苗进行系统研究。结果：外植体的最佳灭菌时间：茎段为2~3 min,叶片为1~2 min;愈伤组织诱导最佳培养基为MS＋2,4-D 1.0 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L;腋芽诱导最佳培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA0.5 mg/L;愈伤组织增殖最佳培养基为MS＋TDZ（0.2~1.0）mg/L＋NAA（0.02~0.05）mg/L;愈伤组织分化最佳培养基为MS＋6-BA（0.5~1.0）mg/L＋NAA（0.02~0.05）mg/L;芽增殖最佳培养基为MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA0.5 mg/L;最佳生根培养为1/2MS＋IBA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L。试管苗在珍珠岩和腐殖质（1∶1）基质中炼苗,成活率达75%以上。结论：筛选出了外植体适宜的消毒方法及愈伤组织诱导、增殖、分化及芽增殖、生根的适宜培养基,建立了‘渝蕾一号’组培快繁体系。

灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’内生菌对其悬浮细胞生物量及绿原酸含量的影响

从灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’中分离出17株内生菌,并采用16S r DNA和18S r DNA分子鉴定结合形态特征鉴定出其中6株。将获得的6株内生菌作为诱导子添加至‘渝蕾1号’悬浮培养体系中,探讨其对‘渝蕾1号’悬浮细胞生物量及绿原酸含量的影响。结果表明,分离得到的6株菌分别为根瘤菌(cc2)、荧光假单孢菌(cc4)、盾壳霉菌(cc5)、高地芽孢杆菌(cc13)、同温层芽孢杆菌(cc14)及短小芽孢杆菌(cc15)。同时,6株内生菌均不同程度地影响‘渝蕾1号’悬浮细胞生物量及次生代谢产物绿原酸含量。对生物量来说,6种内生菌均在浓度为25 mg·L-1时,生物量达到最大值。对绿原酸来说,根瘤菌、荧光假单孢菌、盾壳霉菌及同温层芽孢杆菌均在浓度为25 mg·L-1时,绿原酸含量达到最大,而高地芽孢杆菌和短小芽孢杆菌在浓度为12.5mg·L-1时,绿原酸含量达到最大。总结以上结果,与对照相比,细胞生物量和绿原酸含量会在菌株的某个浓度下大大提高,该结果为绿原酸的工业化生产打下了基础。

金银花与灰毡毛忍冬治疗流感病毒FM1肺炎小鼠作用比较

目的:研究金银花和灰毡毛忍冬对流感病毒FM1所致肺炎小鼠的治疗作用和抗流感病毒功效差异。方法:建模给药后第2、第4、第6天分别测定金银花和灰毡毛忍冬水提液对肺炎小鼠的肺部炎症抑制作用、死亡保护作用、肺组织的病毒载量、病理切片变化、炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素(IL-6)基因表达的变化,动态、系统地评价二者抗病毒功效。结果:二者都可抑制肺炎小鼠体质量的下降,对小鼠的死亡保护率分别为31.43%和12.61%,第6天肺指数抑制率分别为30.89%和17.89%,都能抑制肺组织病毒载量,逆转TNF-α和IL-6种炎症因子mRNA升高,小鼠肺组织病变明显改善,偶见炎症细胞浸润,灶性分布的病理改变消失,且金银花治疗效果略优于灰毡毛忍冬。结论:金银花和灰毡毛忍冬都能抑制流感病毒FM1感染造成的小鼠肺损伤,但金银花治疗效果略优于灰毡毛忍冬。

灰毡毛忍冬Lm-XL-AP1基因克隆、生物信息学和时空表达分析

目的克隆灰毡毛忍冬突变型品种AP1基因(Lm-XL-AP1),并对其进行生物信息学和时空表达分析。方法通过RACE技术克隆Lm-XL-AP1基因全长,运用生物信息学的方法进行基因同源性和相似性比较分析,预测其编码蛋白,并对其进行各种理化性质分析。运用荧光定量PCR(q RT-PCR)检测该基因在灰毡毛忍冬突变型植株不同花期和不同器官的相对表达量。结果获得AP1基因,开放阅读框(ORF)长729 bp,编码242个氨基酸,与甘菊中MADS-box基因家族AP1基因相似性达80%,且包含MADS和K-box的保守序列。AP1蛋白无跨膜区域,定位于细胞核中;在灰毡毛忍冬突变型植株第6花期相对表达量最高,同时茎、叶中也有表达。结论成功从灰毡毛忍冬突变型植株总RNA中克隆到可能参与控制花器官表达的AP1基因。

不同品种灰毡毛忍冬ACS3基因克隆、表达及生物信息学分析

目的分别克隆灰毡毛忍冬野生型与湘蕾型ACS3基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法筛选灰毡毛忍冬转录组数据库中与ACS蛋白同源性较高的Unigene序列,设计引物,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RACE技术对该Unigene进行全长克隆;用生物信息学软件分析蛋白的理化性质、结构域和同源性等特性;借助qRT-PCR检测1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACS3)基因在不同品种、不同花期灰毡毛忍冬中表达模式。结果从灰毡毛忍冬野生品种及湘蕾品种中分别克隆得Lm-ACS3(GenBank:MH724196)及Lm-XL-ACS3(GenBank:MH724197),开放阅读框长度均为1452bp,编码483个氨基酸,包含保守的Aminotran_1_2结构域,与其他植物的ACC合酶具较高相似度;qRT-PCR结果显示,野生型ACS3基因不同花期间表达差异显著,从花期3开始呈整体明显上升趋势,湘蕾型中花期间表达差异相对较小。结论分别克隆得到灰毡毛忍冬野生型和湘蕾型ACS3基因,该基因在2品种中具不同表达模式;推测ACS3基因或为导致灰毡毛忍冬不同品种间差异表型的可能功能基因之一,为进一步验证该基因在调控蕾期长短及花表型的生物学功能提供实验基础。