灰葡萄孢菌两种发酵粗提物对烟蚜的杀虫活性初步研究

用浸渍法测定灰葡萄孢菌的固体和液体发酵粗提物对烟蚜的触杀活性。结果表明:液体和固体的发酵产物对烟蚜都有杀虫活性,且固体发酵产物的触杀活性大于液体发酵产物,30 h后的LC50分别为0.4836 mg/mL和3.8036 mg/mL。

解淀粉芽孢杆菌PB-1对灰葡萄孢的抑菌机理

为筛选灰葡萄孢(Botrytis cinerea)高效生防菌株,对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株PB-1从抑菌谱、发酵液的抑菌作用、抗生素合成基因PCR检测、挥发性物质(VOC)的抑菌作用、离体叶片防效几个方面进行研究。研究结果表明,PB-1的抑菌谱较广,对8种供试植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对灰葡萄孢(B.cinerea)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)4种病原真菌具有较强的抑制作用,抑菌率分别为63.5%、70.7%、63.4%、56.0%。PB-1发酵液不仅对灰葡萄孢菌丝生长具较强抑制作用(20%浓度发酵液抑菌率达96.6%,受抑制菌丝肿胀扭曲、原生质外渗、分枝异常),而且对分生孢子萌发也具有强烈抑制作用。抗生素合成基因PCR检测发现,PB-1扩增出srfAB、ituA基因片段,这说明PB-1能够产生表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturins)脂肽类抗生素。PB-1挥发性物质对灰葡萄孢菌丝生长也具有明显抑制作用。此外,小白菜品种上海青离体叶片防病效果检测发现,PB-1能明显抑制灰葡萄孢的侵染。本研究结果表明,PB-1有作为植物灰霉病生物防治菌剂的潜力。

灰葡萄孢寄生菌Clpse01的杀线活性研究

在用灰葡萄孢菌Botrytis cinerea培养松材线虫的过程中,发掘了一株具有杀线活性的灰葡萄孢寄生菌Clpse01。本文在光学显微镜下对菌株Clpse01的形态和其对灰葡萄孢菌的生长影响进行了观察;采用ITS4/ITS5、LR5/LR0R、Bt2a/Bt2b和EF1-688F/EF1-1251R引物进行了分子生物学鉴定;同时测试了菌株Clpse01对松材线虫的杀线活性及对松材线虫卵孵化能力和繁殖能力的影响;最后测试了菌株Clpse01的胞外蛋白浓度,胞外β-葡萄糖苷酶活性和胞外几丁质酶活性。根据形态学和分子生物学结果,将菌株Clpse01鉴定为假卡鲁卡枝惠霉Clonostachyspseudochroleuca。菌株Clpse01可以缠绕、侵入灰葡萄孢菌的菌丝以获得营养来源,使灰葡萄孢菌的菌丝生长受到抑制。将2000条松材线虫接种到长满菌株Clpse01的培养基上,8 d后仅分离出6条/皿活线虫,而对照灰葡萄孢菌培养基上分离的线虫数为33066条/皿活线虫;菌株Clpse01发酵液处理松材线虫48 h后的校正死亡率为88%,浓度为1×108孢子/mL的孢子悬液处理松材线虫24 h后的校正死亡率为88.33%;菌株Clpse01 2×稀释发酵液24 h对卵的孵化抑制率为100%。发酵培养6 h后,菌株Clpse01胞外蛋白浓度为1782.917μg/mL,胞外β-葡萄糖苷酶为9.99 U/mL,胞外几丁质酶含量为0.8792U/mL,并随发酵时间推移而升高。菌株Clpse01通过寄生松材线虫的食物来源灰葡萄孢菌和影响松材线虫的繁殖、存活和卵的孵化起作用,胞外β-葡萄糖苷酶、几丁质酶是毒杀松材线虫的两个重要生理因子。

生防真菌T1-3的筛选、鉴定及对灰葡萄孢菌的拮抗作用研究

为筛选能拮抗灰葡萄孢菌的真菌菌株作为灰霉病生物防治的菌株资源储备,从番茄的根际土壤中筛选得到一株对灰葡萄孢菌具有拮抗作用的真菌,通过形态学和分子生物学对其进行了鉴定,并对其拮抗机制进行了研究.结果表明,菌株T1-3为一株长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum),其生长速率较病原菌快,对病原菌的抑菌率为87.75%;其无菌发酵滤液对病原菌的抑制率为84.75%,另对病原菌孢子萌发抑制率为80.51%,具有明显的抑制作用;且菌株T1-3生长过程中能够产生果胶酶和淀粉酶.长枝木霉T1-3具有良好的生防潜力和应用前景.

4种胡椒科植物粗提物对灰葡萄孢的抑菌活性

在离体条件下比较了胡椒科荜茇、假蒟、黑胡椒、白胡椒4种植物乙醇提取物对灰葡萄孢的抑菌活性。结果表明:4种植物乙醇提取物对灰葡萄孢发育各阶段具有较强的抑制作用。白胡椒乙醇提取物对菌丝生长的抑制作用最强,EC_(50)为0.007 9 g·m L^(-1),其次为荜茇、黑胡椒和假蒟;当浓度为0.5 g·m L^(-1)时,荜茇和假蒟的乙醇提取物对灰葡萄孢产孢量抑制作用最强,抑制率分别为92.8%和92.0%;黑胡椒和白胡椒乙醇提取物对灰葡萄孢孢子萌发的抑制作用强于荜茇和假蒟;4种植物粗提物浓度高于0.062 5 g·m L^(-1)时,均能完全抑制灰葡萄孢菌核产生。

葡萄致腐菌灰葡萄孢及其拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定

分离筛选出对葡萄致腐菌灰葡萄孢有较强拮抗作用的拮抗菌,丰富葡萄采后保鲜拮抗菌资源,以期为葡萄灰霉病的生物防治提供理论依据和奠定应用基础。利用组织块分离法在腐烂的葡萄果实中分离得到灰葡萄孢,梯度稀释法从葡萄园土壤中分离得到潜力拮抗菌,通过平板对峙及琼脂扩散法筛选出拮抗作用较强的生防菌,并通过形态学观察、生理生化测定、生物学鉴定确定其种属。通过对拮抗菌进行溶血性测定初步探索其是否对人体有溶血作用。分离得到的葡萄致腐菌通过形态学观察,病原菌PH-23菌丝初期呈灰白色,继续培养会逐渐转变为淡淡的青灰褐色,菌丝繁盛,孢子众多。对病原菌PH-23进行ITS、β-tub序列分析,结合形态学特征确定其为灰葡萄孢。致病力测定结果表明,PH-23接种后葡萄症状与葡萄灰霉病症状相符,腐烂严重。筛选得到对葡萄致腐菌PH-23拮抗作用较强的生防菌TP-1,抑菌圈直径为22.49 mm。通过形态学观察,菌体为杆状,芽孢呈椭圆形,大小为0.62μm×2.35μm。TP-1革兰氏染色阳性。生理生化鉴定结果初步认为TP-1为芽孢杆菌。基于16S rDNA基因、rpoB基因、gyrB基因序列分析确定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。拮抗菌TP-1的溶血性测定显示其对人体无溶血作用。拮抗菌TP-1对灰葡萄孢有较强的拮抗作用,在葡萄采后贮藏及生物保鲜中具有潜在的应用价值。

灰葡萄孢菌BcGLS基因的克隆、生物信息学分析及逆境胁迫下转录表达分析

β-1,3-葡聚糖合成酶(β-1,3-glucan synthase,GLS)催化合成的细胞壁核心组分β-1,3-葡聚糖对真菌的生存和毒力至关重要,该酶是研发抗菌药物的重要作用靶点。为了了解β-1,3-葡聚糖合成酶基因(BcGLS)在灰葡萄孢菌生存和侵染进程中的功能,该研究通过克隆获得BcGLS全长序列,序列全长7137 bp,编码1932个氨基酸,生物信息学分析结果显示,其编码蛋白(BcGLSp)理论相对分子质量为220.05 kDa,理论等电点为7.97;亚细胞预测其定位于细胞膜,存在17个跨膜结构,不存在信号肽,为非分泌蛋白;含有176个磷酸化位点,为亲水性蛋白。保守结构域分析结果表明,BcGLSp含有一个β-1,3-葡聚糖合成酶结构域和一个β-1,3-葡聚糖合成酶亚基FKS1,属于葡聚糖合成酶超家族。系统进化分析表明,灰葡萄孢菌BcGLS与植物致病菌如山茶叶杯菌、景天白粉菌等的葡聚糖合成酶亲缘关系近。不同逆境胁迫条件(氯化钠、十二烷基硫酸钠、过氧化氢)显著抑制灰葡萄孢菌菌丝生长,实时定量PCR进一步分析显示BcGLS在不同非生物胁迫条件下均上调表达,表明BcGLS基因的转录表达与环境压力密切相关。该研究为深入探讨BcGLS在灰葡萄孢菌生存和侵染进程中的基因功能和灰葡萄孢菌的新型防治策略提供理论材料和实践依据。

灰葡萄孢BC7-3菌株固体发酵条件的优化

【目的】探讨灰葡萄孢BC7-3菌株固体发酵的基本条件以提高其除草活性物质的产量。【方法】通过正交试验设计确定最优化的培养基组合,并结合生长抑制法测定外加碳源、氮源等因素对除草活性物质产生的影响,以确定最佳的发酵条件。【结果】确定了小米5 g、高粱5 g、麦麸5 g、玉米秸秆2.5 g为最佳复合培养基质;明确了该菌株在加入1%硝酸铵、1%蔗糖的培养基中,20℃黑暗条件下,接种量8%、含水量80%、静置培养15 d,得到的除草活性物质活性最强。【结论】固体发酵适合于灰葡萄孢代谢产物中除草活性物质的产生。

灰葡萄孢霉菌固体培养产生的(+)ABA及其生物学效应

目前已筛选出的Botrysits、Cercospord等属菌株能合成次生代谢物ABA。这已成为化学家和生物学研究者感兴趣的课题,然而尚存在一些亟待解决的问题。由于天然ABA纯度高(大于97％),且生理活性较强,是开发ABA的新途径。本文应用草莓灰葡萄孢菌株,通过试探性的实验,用简便的固体发酵方式培养。

拮抗灰葡萄孢菌乳酸菌的筛选与鉴定

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是导致果蔬腐败的主要病原菌之一。乳酸菌因为安全、无毒且具有一定的抗菌作用,在抑制果蔬腐败病原菌方面具有一定的潜在价值。鉴于此,文章期望从发酵食品和常见水果表面分离并筛选出抑制灰葡萄孢菌活性的乳酸菌,结果发现有10株乳酸菌对灰葡萄孢具有抑菌活性。经鉴定,3株(JZ a1、MJ a2、PS b1)为Limosilac tobacillus fe rme ntum,2株(ZLJ、MDF b)为Lactobac illus pentosus,MHT b为Lactobacillus ac idophilus,4株(SCb1、MJ a、MDF a、MHT a1)还有待进一步鉴定。文章为开发果蔬生物保鲜剂提供了实践基础与理论支撑。

氟吡菌酰胺与咯菌腈混配对灰葡萄孢菌的联合毒力及药效评价

筛选氟吡菌酰胺和咯菌腈对灰葡萄孢菌的增效组合。通过菌丝生长抑制法测定两种药剂之间的最佳配比组合,并通过离体叶片法和田间药效试验验证最佳配比。氟吡菌酰胺与咯菌腈以质量比为3:1、2:1、1:1、2:3、1:2、2:5和1:3的比例进行混配时,其对灰霉菌生长抑制的增效系数都大于1.5,表现明显的增效作用,其中以质量比为2:3的组合增效作用最强。30%氟吡菌酰胺·咯菌腈SC(2:3)用量在25~35 mL/666m^(2)时,离体叶片法和大田试验中均表现出了优异的防治效果。30%氟吡菌酰胺·咯菌腈SC配比为2:3时,对番茄灰霉病有极佳的防控效果,推荐剂量为25~35 mL/666m^(2)。

啶酰菌胺与唑胺菌酯混配对灰葡萄孢毒力的增效作用

为明确啶酰菌胺与唑胺菌酯对灰葡萄孢Botrytis cinerea毒力的增效作用,采用菌丝生长速率法测定了啶酰菌胺与唑胺菌酯不同配比混合物对灰葡萄孢菌株DZ3（对多菌灵、乙霉威和嘧霉胺高抗）的毒力,以Wadley公式评价了其协同作用。选取最佳增效组合,采用黄瓜子叶喷雾法测定了其对其他5个菌株的毒力及田间防效。通过测定菌株DZ3分生孢子悬浮液中的溶氧量、电导率和菌丝中丙二醛的含量,研究最佳增效组合的增效机制。结果表明：啶酰菌胺与唑胺菌酯不同质量比（9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7和1∶9）的混合物均对菌株DZ3表现为毒力增效作用,其中质量比为1∶3的组合增效最明显,增效系数达4.76,且对另外5个供试菌株的联合毒力也表现出增效;在使用剂量为有效成分200~300 g/hm2时,质量比为1∶3的组合对番茄灰霉病的防治效果为78.05%~93.96%,同时其对菌株DZ3的呼吸抑制作用与单剂啶酰菌胺相当,但对细胞膜通透性和菌丝膜脂质过氧化的影响均显著高于各单剂。本研究结果表明,啶酰菌胺与唑胺菌酯以质量比1∶3进行混配,可用于番茄灰霉病的防治。

枯草芽孢杆菌Loq18抗菌蛋白的分离纯化及其对灰葡萄孢的抑制活性

从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Loq18的代谢产物中纯化一种抗菌蛋白,并进行理化性质及其对灰霉病病原菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的抑制作用研究.采用柱层析分离纯化抗菌蛋白,应用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI/TOF/TOF/MS)测定分子质量,并对其理化特性进行分析.通过显微观察法研究其对灰葡萄孢生长的影响,依据对灰葡萄孢生长抑制率与蛋白质量浓度的线性关系建立毒力方程,计算IC50值.通过体内接种灰葡萄孢,研究抗菌蛋白对采后草莓和葡萄腐烂率的影响,探究其对灰霉病的抑制活性.经测定抗菌蛋白LP18的分子质量为8 568.5 Da,含有Leu、Glu、Asp等14种氨基酸,不含脂基和糖基;具有明显抑制灰葡萄孢生长的能力,其抑制灰葡萄孢生长的毒力方程为y=0.214 0x+13.517,r2=0.996 4,IC50值为170μg/m L;经抗菌蛋白处理的灰葡萄孢,在显微镜下可观察到菌丝出现原生质囊泡化、变形、断裂.体内抑制实验表明当对照组果实的腐烂率达到100%时,处理组草莓和葡萄果实的腐烂率分别为60.33%±6.30%和45.33%±6.30%.抗菌蛋白LP18对灰葡萄孢有明显的抑制作用,可造成灰葡萄孢的菌丝出现原生质囊泡化、断裂、畸形,对采后草莓和葡萄的灰霉病有较明显的抑制效果,可延长其保质期.

丝瓜伤流液对灰葡萄孢的抑菌活性

采用离体、活体试验研究了丝瓜伤流液对灰葡萄孢的抑制活性。结果表明 ,丝瓜伤流液能明显抑制灰葡萄孢的生长、产孢和侵染致病 ;加热 80℃以下抑菌活性稳定 ,室温下保存 1年以上抑菌效果仍很明显。

不同抗性型灰葡萄孢菌Botrytis cinerea对不同作用机制杀菌剂的敏感性研究

不同类型杀菌剂对灰葡萄孢菌菌株的离体、活体毒力测定结果表明 ,苯并咪唑类的多菌灵、甲基硫菌灵之间 ,二甲酰亚胺类的腐霉利、异菌脲、菌核净之间表现交互抗性 ;苯并咪唑类和 N -苯氨基甲酸酯类乙霉威表现有负交互抗性趋势。离体测定中 ,对不同类型菌株以吡咯类杀菌剂咯菌腈 (EC50 <0 .0 2 mg/ L )毒力最高 ,其次为嘧啶胺类杀菌剂嘧霉胺和甾醇抑制剂中的戊唑醇、氟硅唑和丙环唑 (EC50 <1mg/ L) ;活体测定表现出与田间效果具有较高的相关性 ,除嘧霉胺的毒力较小 (EC50 >2 0 0 mg/ L) ,咯菌腈以及甾醇抑制剂戊唑醇。

根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌遗传转化研究

以pCAMBIA1300-N载体为骨架,成功构建了以绿色荧光蛋白(gfp)为报告基因,潮霉素(hph)为抗性筛选标记的载体pKPG,并利用根癌农杆菌介导转化系统,成功获得了能表达绿色荧光蛋白的重组灰葡萄孢菌。通过PCR检测转化子的绿色荧光蛋白基因和潮霉素抗性表达框,观察菌丝和分生孢子的荧光表型,以及gfp基因的Southern杂交验证,结果表明:被测转化子基因组中均成功整合了目的基因片段。

灰葡萄孢菌对啶菌噁唑的敏感性基线及抗药突变体的诱导与生物学性状

从河北省不同地区未使用过啶菌噁唑的保护地中采集黄瓜或番茄灰霉病果、病叶,经单孢分离获得102株灰葡萄孢菌,采用菌丝生长速率法测定其对啶菌噁唑的敏感性,所得EC50值在0.04600.1991μg/mL之间,平均为（0.1182±0.0363）μg/mL,其敏感性呈连续单峰曲线分布,可作为灰葡萄孢菌对啶菌噁唑的敏感性基线。采用紫外线诱导获得了7株抗药突变体,抗药突变体的菌落直径、菌丝干重、产孢量和致病性明显低于其亲本菌株,继代培养9代后抗药突变体的抗药性倍数下降。

灰葡萄孢多药抗性菌株的筛选和鉴定

从浙江杭州市售草莓上分离得到83个灰葡萄孢菌株,测定了这些菌株对苯醚菌酯、多菌灵和异菌脲的敏感性,筛选出对这3种药剂同时产生了抗性的两个菌株HZ021和HZ054,其在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上的菌丝生长和产孢量与敏感菌株相比无显著差异,在黄瓜叶片上均表现出很强的致病力。结果表明,HZ021和HZ 054有很高的适合度。通过对抗性菌株中细胞色素b(CYT b)、双组份组氨酸激酶(OS-1)和β-微管蛋白(TUB 2)基因序列进行分析发现,HZ021和HZ054对多种药剂的抗性是由于其药剂靶标基因上的点突变所致。

蔬菜作物灰葡萄孢菌对不同类型杀菌剂的抗性评价

为评价灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的抗药性发展现状,采用菌丝生长速率法测定了自华北地区蔬菜作物上分离得到的85株灰葡萄孢菌对苯并咪唑类(多菌灵)、二甲酰亚胺类(腐霉利)、N-苯氨基甲酸酯类(乙霉威)、苯胺基嘧啶类(嘧霉胺)、酰胺类(啶酰菌胺)以及苯并吡咯类(咯菌腈)等6种不同类型杀菌剂的敏感性。结果表明:华北地区蔬菜作物上的灰葡萄孢菌对6种不同类型杀菌剂均产生了不同程度的抗药性,其中防治灰霉病的常用杀菌剂嘧霉胺、啶酰菌胺以及新型杀菌剂咯菌腈的抗药性发展迅速。灰葡萄孢菌对传统杀菌剂多菌灵、腐霉利、乙霉威的抗性水平较高,总抗性频数分别为72.94%、51.76%、69.41%;多菌灵-乙霉威双抗频数为51.76%,多菌灵-腐霉利-乙霉威三抗频数为34.12%。灰葡萄孢菌对目前防治灰霉病的主要杀菌剂嘧霉胺及啶酰菌胺也已经产生了较高水平的抗性,其抗性频数分别为64.71%和65.88%。而对于新型杀菌剂咯菌腈的抗性频数为36.47%。共发现了40种多重抗药性的类型,且有32种多抗类型未曾报道;1株灰葡萄孢菌对6类杀菌剂均表现敏感,抗性频数为1.18%;5株灰葡萄孢菌对6类杀菌剂均表现抗性,抗性频数为5.88%。实际生产应用中应尽量避免单一杀菌剂的长期重复使用,建议多种药剂配合使用以延长杀菌剂的使用寿命。