解淀粉芽孢杆菌PB-1对灰葡萄孢的抑菌机理

为筛选灰葡萄孢(Botrytis cinerea)高效生防菌株,对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株PB-1从抑菌谱、发酵液的抑菌作用、抗生素合成基因PCR检测、挥发性物质(VOC)的抑菌作用、离体叶片防效几个方面进行研究。研究结果表明,PB-1的抑菌谱较广,对8种供试植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对灰葡萄孢(B.cinerea)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)4种病原真菌具有较强的抑制作用,抑菌率分别为63.5%、70.7%、63.4%、56.0%。PB-1发酵液不仅对灰葡萄孢菌丝生长具较强抑制作用(20%浓度发酵液抑菌率达96.6%,受抑制菌丝肿胀扭曲、原生质外渗、分枝异常),而且对分生孢子萌发也具有强烈抑制作用。抗生素合成基因PCR检测发现,PB-1扩增出srfAB、ituA基因片段,这说明PB-1能够产生表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturins)脂肽类抗生素。PB-1挥发性物质对灰葡萄孢菌丝生长也具有明显抑制作用。此外,小白菜品种上海青离体叶片防病效果检测发现,PB-1能明显抑制灰葡萄孢的侵染。本研究结果表明,PB-1有作为植物灰霉病生物防治菌剂的潜力。

灰葡萄孢寄生菌Clpse01的杀线活性研究

在用灰葡萄孢菌Botrytis cinerea培养松材线虫的过程中,发掘了一株具有杀线活性的灰葡萄孢寄生菌Clpse01。本文在光学显微镜下对菌株Clpse01的形态和其对灰葡萄孢菌的生长影响进行了观察;采用ITS4/ITS5、LR5/LR0R、Bt2a/Bt2b和EF1-688F/EF1-1251R引物进行了分子生物学鉴定;同时测试了菌株Clpse01对松材线虫的杀线活性及对松材线虫卵孵化能力和繁殖能力的影响;最后测试了菌株Clpse01的胞外蛋白浓度,胞外β-葡萄糖苷酶活性和胞外几丁质酶活性。根据形态学和分子生物学结果,将菌株Clpse01鉴定为假卡鲁卡枝惠霉Clonostachyspseudochroleuca。菌株Clpse01可以缠绕、侵入灰葡萄孢菌的菌丝以获得营养来源,使灰葡萄孢菌的菌丝生长受到抑制。将2000条松材线虫接种到长满菌株Clpse01的培养基上,8 d后仅分离出6条/皿活线虫,而对照灰葡萄孢菌培养基上分离的线虫数为33066条/皿活线虫;菌株Clpse01发酵液处理松材线虫48 h后的校正死亡率为88%,浓度为1×108孢子/mL的孢子悬液处理松材线虫24 h后的校正死亡率为88.33%;菌株Clpse01 2×稀释发酵液24 h对卵的孵化抑制率为100%。发酵培养6 h后,菌株Clpse01胞外蛋白浓度为1782.917μg/mL,胞外β-葡萄糖苷酶为9.99 U/mL,胞外几丁质酶含量为0.8792U/mL,并随发酵时间推移而升高。菌株Clpse01通过寄生松材线虫的食物来源灰葡萄孢菌和影响松材线虫的繁殖、存活和卵的孵化起作用,胞外β-葡萄糖苷酶、几丁质酶是毒杀松材线虫的两个重要生理因子。

生防真菌T1-3的筛选、鉴定及对灰葡萄孢菌的拮抗作用研究

为筛选能拮抗灰葡萄孢菌的真菌菌株作为灰霉病生物防治的菌株资源储备,从番茄的根际土壤中筛选得到一株对灰葡萄孢菌具有拮抗作用的真菌,通过形态学和分子生物学对其进行了鉴定,并对其拮抗机制进行了研究.结果表明,菌株T1-3为一株长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum),其生长速率较病原菌快,对病原菌的抑菌率为87.75%;其无菌发酵滤液对病原菌的抑制率为84.75%,另对病原菌孢子萌发抑制率为80.51%,具有明显的抑制作用;且菌株T1-3生长过程中能够产生果胶酶和淀粉酶.长枝木霉T1-3具有良好的生防潜力和应用前景.

葡萄致腐菌灰葡萄孢及其拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定

分离筛选出对葡萄致腐菌灰葡萄孢有较强拮抗作用的拮抗菌,丰富葡萄采后保鲜拮抗菌资源,以期为葡萄灰霉病的生物防治提供理论依据和奠定应用基础。利用组织块分离法在腐烂的葡萄果实中分离得到灰葡萄孢,梯度稀释法从葡萄园土壤中分离得到潜力拮抗菌,通过平板对峙及琼脂扩散法筛选出拮抗作用较强的生防菌,并通过形态学观察、生理生化测定、生物学鉴定确定其种属。通过对拮抗菌进行溶血性测定初步探索其是否对人体有溶血作用。分离得到的葡萄致腐菌通过形态学观察,病原菌PH-23菌丝初期呈灰白色,继续培养会逐渐转变为淡淡的青灰褐色,菌丝繁盛,孢子众多。对病原菌PH-23进行ITS、β-tub序列分析,结合形态学特征确定其为灰葡萄孢。致病力测定结果表明,PH-23接种后葡萄症状与葡萄灰霉病症状相符,腐烂严重。筛选得到对葡萄致腐菌PH-23拮抗作用较强的生防菌TP-1,抑菌圈直径为22.49 mm。通过形态学观察,菌体为杆状,芽孢呈椭圆形,大小为0.62μm×2.35μm。TP-1革兰氏染色阳性。生理生化鉴定结果初步认为TP-1为芽孢杆菌。基于16S rDNA基因、rpoB基因、gyrB基因序列分析确定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。拮抗菌TP-1的溶血性测定显示其对人体无溶血作用。拮抗菌TP-1对灰葡萄孢有较强的拮抗作用,在葡萄采后贮藏及生物保鲜中具有潜在的应用价值。

灰葡萄孢菌BcGLS基因的克隆、生物信息学分析及逆境胁迫下转录表达分析

β-1,3-葡聚糖合成酶(β-1,3-glucan synthase,GLS)催化合成的细胞壁核心组分β-1,3-葡聚糖对真菌的生存和毒力至关重要,该酶是研发抗菌药物的重要作用靶点。为了了解β-1,3-葡聚糖合成酶基因(BcGLS)在灰葡萄孢菌生存和侵染进程中的功能,该研究通过克隆获得BcGLS全长序列,序列全长7137 bp,编码1932个氨基酸,生物信息学分析结果显示,其编码蛋白(BcGLSp)理论相对分子质量为220.05 kDa,理论等电点为7.97;亚细胞预测其定位于细胞膜,存在17个跨膜结构,不存在信号肽,为非分泌蛋白;含有176个磷酸化位点,为亲水性蛋白。保守结构域分析结果表明,BcGLSp含有一个β-1,3-葡聚糖合成酶结构域和一个β-1,3-葡聚糖合成酶亚基FKS1,属于葡聚糖合成酶超家族。系统进化分析表明,灰葡萄孢菌BcGLS与植物致病菌如山茶叶杯菌、景天白粉菌等的葡聚糖合成酶亲缘关系近。不同逆境胁迫条件(氯化钠、十二烷基硫酸钠、过氧化氢)显著抑制灰葡萄孢菌菌丝生长,实时定量PCR进一步分析显示BcGLS在不同非生物胁迫条件下均上调表达,表明BcGLS基因的转录表达与环境压力密切相关。该研究为深入探讨BcGLS在灰葡萄孢菌生存和侵染进程中的基因功能和灰葡萄孢菌的新型防治策略提供理论材料和实践依据。

拮抗灰葡萄孢菌乳酸菌的筛选与鉴定

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是导致果蔬腐败的主要病原菌之一。乳酸菌因为安全、无毒且具有一定的抗菌作用,在抑制果蔬腐败病原菌方面具有一定的潜在价值。鉴于此,文章期望从发酵食品和常见水果表面分离并筛选出抑制灰葡萄孢菌活性的乳酸菌,结果发现有10株乳酸菌对灰葡萄孢具有抑菌活性。经鉴定,3株(JZ a1、MJ a2、PS b1)为Limosilac tobacillus fe rme ntum,2株(ZLJ、MDF b)为Lactobac illus pentosus,MHT b为Lactobacillus ac idophilus,4株(SCb1、MJ a、MDF a、MHT a1)还有待进一步鉴定。文章为开发果蔬生物保鲜剂提供了实践基础与理论支撑。

氟吡菌酰胺与咯菌腈混配对灰葡萄孢菌的联合毒力及药效评价

筛选氟吡菌酰胺和咯菌腈对灰葡萄孢菌的增效组合。通过菌丝生长抑制法测定两种药剂之间的最佳配比组合,并通过离体叶片法和田间药效试验验证最佳配比。氟吡菌酰胺与咯菌腈以质量比为3:1、2:1、1:1、2:3、1:2、2:5和1:3的比例进行混配时,其对灰霉菌生长抑制的增效系数都大于1.5,表现明显的增效作用,其中以质量比为2:3的组合增效作用最强。30%氟吡菌酰胺·咯菌腈SC(2:3)用量在25~35 mL/666m^(2)时,离体叶片法和大田试验中均表现出了优异的防治效果。30%氟吡菌酰胺·咯菌腈SC配比为2:3时,对番茄灰霉病有极佳的防控效果,推荐剂量为25~35 mL/666m^(2)。

灰葡萄孢菌两种发酵粗提物对烟蚜的杀虫活性初步研究

用浸渍法测定灰葡萄孢菌的固体和液体发酵粗提物对烟蚜的触杀活性。结果表明:液体和固体的发酵产物对烟蚜都有杀虫活性,且固体发酵产物的触杀活性大于液体发酵产物,30 h后的LC50分别为0.4836 mg/mL和3.8036 mg/mL。

膜醭毕赤酵母挥发性物质对灰葡萄孢菌的抑菌活性及组分分析

为探究膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)对采后灰葡萄孢菌的抑菌机制,该研究对其挥发性物质进行了抑菌活性与抑菌机制分析。结果表明,灰葡萄孢菌被挥发性物质熏蒸48 h时,菌丝长势明显受阻,抑制率高达72.41%,其产孢量始终低于空白组(P<0.05)。经熏蒸后72 h,菌丝体细胞膜内核酸、蛋白质的大量外泄(P<0.05)改变了细胞膜的通透性,同时,通过扫描电镜观察到处理过的菌丝表面出现干瘪、皱缩甚至部分菌丝胞内的内容物渗漏。有伤接种实验证明熏蒸处理的番茄果实病斑直径仅为(1.47±0.16)cm,显著低于空白对照组。利用顶空固相微萃取-气质联用法(headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分离鉴定到20种挥发性物质,主要组分为醇类(39.26%)、酮类(24.72%)和有机酸类物质(8.51%)。上述结果为研究酵母菌防控采后果蔬腐烂提供了理论依据,为生防菌的安全防腐策略提供新思路。

4种胡椒科植物粗提物对灰葡萄孢的抑菌活性

在离体条件下比较了胡椒科荜茇、假蒟、黑胡椒、白胡椒4种植物乙醇提取物对灰葡萄孢的抑菌活性。结果表明:4种植物乙醇提取物对灰葡萄孢发育各阶段具有较强的抑制作用。白胡椒乙醇提取物对菌丝生长的抑制作用最强,EC_(50)为0.007 9 g·m L^(-1),其次为荜茇、黑胡椒和假蒟;当浓度为0.5 g·m L^(-1)时,荜茇和假蒟的乙醇提取物对灰葡萄孢产孢量抑制作用最强,抑制率分别为92.8%和92.0%;黑胡椒和白胡椒乙醇提取物对灰葡萄孢孢子萌发的抑制作用强于荜茇和假蒟;4种植物粗提物浓度高于0.062 5 g·m L^(-1)时,均能完全抑制灰葡萄孢菌核产生。

人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑敏感基线的建立及抗药性监测

为了解人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性情况,采用菌丝生长速率法测定了人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感性,采用最小抑菌浓度法监测人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性。结果表明:氯氟醚菌唑对供试的148株人参灰葡萄孢菌株的EC_(50)值为0.008 4~2.795 8 mg/L,其敏感性频率分布呈连续单峰曲线,经K-S法检验符合正态分布,未出现敏感性明显下降的抗药性菌株群体,EC50平均值为0.174 4 mg/L,可作为人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线;不同地区来源、不同年份分离的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性差异显著(P<0.05);所检测的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的抗药性水平多数为敏感菌株和低抗菌株,只有吉林省抚松县和集安市有少量中抗和高抗菌株,抗性频率均在3.70%以下。本研究为氯氟醚菌唑防治人参灰霉病提供了技术依据。

灰葡萄孢对氟啶胺的敏感性检测及敏感性降低菌株生物学性状研究

为评价灰霉病菌对氟啶胺的敏感性及抗药性风险,本试验于2020年-2021年在吉林、江西、湖北、山东、北京、湖南等地区的草莓、辣椒、四季豆、茄子和番茄上采集病叶、病茎、病花和病果,经单孢分离获得117个灰葡萄孢Botrytis cinerea菌株,采用菌丝生长速率法测定其对氟啶胺的敏感性。结果表明:有4株灰葡萄孢BJ14、BJ45、BJ46和BJ47对氟啶胺的敏感性显著降低,EC_(50)在0.1137~0.3946μg/mL,抗性倍数为4.7~16.3,MIC值>4μg/mL。其余113个菌株对氟啶胺的平均EC_(50)为0.0251μg/mL。敏感性降低的4个菌株继代培养10代后,抗药性状稳定。交互抗性测定结果表明,对氟啶胺敏感性下降的菌株对腐霉利和咯菌腈2种杀菌剂表现为敏感,氟啶胺与腐霉利或咯菌腈没有交互抗性。生物学性状研究表明,4株敏感性下降菌株在PDA平板上的生长速率和在番茄果实上的致病力都显著低于敏感菌株,而菌丝生物量、产孢量和孢子萌发率与敏感菌株无显著差异。以上研究结果表明,田间已存在对氟啶胺敏感性降低的菌株,鉴于灰葡萄孢属于高风险抗性菌株,建议氟啶胺在防治灰霉病的使用中需谨慎。

氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌的联合毒力及田间药效

[目的]筛选出氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌的增效组合。[方法]采用菌丝生长速率法测定氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌菌丝生长的联合毒力,并采用孢子萌发法和田间药效试验对优选出的配比进行验证。[结果]氟吡菌酰胺与百菌清以有效成分质量比10∶40、8∶42、6∶44、5.5∶44.5、5∶45、4∶46和3∶47混配抑菌菌丝生长的共毒系数(CTC)均大于120,表现增效作用。混配药剂对孢子萌发的抑制效果随百菌清含量增加而增强。41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂与720 g/L百菌清悬浮剂按照有效成分质量比8∶42桶混在900~1 500 mg/L剂量下对番茄灰霉病的防治效果与对照药剂41.7%氟吡菌酰胺SC(400 mg/L)相当,略优于43%氟菌·肟菌酯SC(400 mg/L),显著优于720 g/L百菌清SC(1 260 mg/L)和50%异菌脲WP(1 000 mg/L)。[结论]氟吡菌酰胺与百菌清按有效成分质量比8∶42混配可以有效防控番茄灰霉病,推荐剂量为900~1 500 mg/L。

贵州山茶花灰斑病葡萄牙拟盘多毛孢菌的生物学特性研究初报

为明确贵州省山茶花葡萄牙拟盘多毛孢菌灰斑病(Pestalotio psisportugalica)病原的生物学特性,针对从种植地采集感病样品中分离出的菌株(编号为schb1),研究碳源、氮源、pH、温度和光照对病原菌菌丝生长的影响。结果表明,该菌菌丝最适生长温度为25℃,最适pH值为6,对碳源蔗糖、氮源酵母膏的利用最高,菌丝生长对光暗交替敏感。研究结果为进一步了解山茶花葡萄牙拟盘多毛孢菌灰斑病发生规律和开展病害综合防治提供了重要参考。

河南省番茄灰霉病病原菌鉴定、生物学特性分析及杀菌剂筛选

番茄灰霉病是番茄生产上的重要病害之一。本试验以河南商丘市蔬菜大棚内疑似患灰霉病番茄植株叶片为试材,采用组织分离法纯化获得3株病原菌菌株,其形态特征一致,选择一株代表性菌株命名为SQBC1。对该菌株rDNA-ITS序列、CHS-1、tubA基因进行测序、比对和系统进化分析,结合菌株培养性状、显微形态学观察、致病性分析,将河南商丘番茄灰霉病致病病原菌确定为灰葡萄孢菌Botryotinia cinerea。生物学特性研究表明28℃为最适生长温度,12 h光照12 h黑暗为最适光照条件,6.0为最适pH值,乳糖为最适碳源,蛋白胨为最适氮源。测试了7种杀菌剂对灰霉菌菌丝生长的抑菌效果,其中嘧菌酯和吡唑醚菌酯的抑菌效果最好。该研究为番茄灰霉病的有效防治提供一定的参考依据。

啶酰菌胺与唑胺菌酯混配对灰葡萄孢毒力的增效作用

为明确啶酰菌胺与唑胺菌酯对灰葡萄孢Botrytis cinerea毒力的增效作用,采用菌丝生长速率法测定了啶酰菌胺与唑胺菌酯不同配比混合物对灰葡萄孢菌株DZ3（对多菌灵、乙霉威和嘧霉胺高抗）的毒力,以Wadley公式评价了其协同作用。选取最佳增效组合,采用黄瓜子叶喷雾法测定了其对其他5个菌株的毒力及田间防效。通过测定菌株DZ3分生孢子悬浮液中的溶氧量、电导率和菌丝中丙二醛的含量,研究最佳增效组合的增效机制。结果表明：啶酰菌胺与唑胺菌酯不同质量比（9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7和1∶9）的混合物均对菌株DZ3表现为毒力增效作用,其中质量比为1∶3的组合增效最明显,增效系数达4.76,且对另外5个供试菌株的联合毒力也表现出增效;在使用剂量为有效成分200~300 g/hm2时,质量比为1∶3的组合对番茄灰霉病的防治效果为78.05%~93.96%,同时其对菌株DZ3的呼吸抑制作用与单剂啶酰菌胺相当,但对细胞膜通透性和菌丝膜脂质过氧化的影响均显著高于各单剂。本研究结果表明,啶酰菌胺与唑胺菌酯以质量比1∶3进行混配,可用于番茄灰霉病的防治。

枯草芽孢杆菌Loq18抗菌蛋白的分离纯化及其对灰葡萄孢的抑制活性

从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Loq18的代谢产物中纯化一种抗菌蛋白,并进行理化性质及其对灰霉病病原菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的抑制作用研究.采用柱层析分离纯化抗菌蛋白,应用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI/TOF/TOF/MS)测定分子质量,并对其理化特性进行分析.通过显微观察法研究其对灰葡萄孢生长的影响,依据对灰葡萄孢生长抑制率与蛋白质量浓度的线性关系建立毒力方程,计算IC50值.通过体内接种灰葡萄孢,研究抗菌蛋白对采后草莓和葡萄腐烂率的影响,探究其对灰霉病的抑制活性.经测定抗菌蛋白LP18的分子质量为8 568.5 Da,含有Leu、Glu、Asp等14种氨基酸,不含脂基和糖基;具有明显抑制灰葡萄孢生长的能力,其抑制灰葡萄孢生长的毒力方程为y=0.214 0x+13.517,r2=0.996 4,IC50值为170μg/m L;经抗菌蛋白处理的灰葡萄孢,在显微镜下可观察到菌丝出现原生质囊泡化、变形、断裂.体内抑制实验表明当对照组果实的腐烂率达到100%时,处理组草莓和葡萄果实的腐烂率分别为60.33%±6.30%和45.33%±6.30%.抗菌蛋白LP18对灰葡萄孢有明显的抑制作用,可造成灰葡萄孢的菌丝出现原生质囊泡化、断裂、畸形,对采后草莓和葡萄的灰霉病有较明显的抑制效果,可延长其保质期.

丝瓜伤流液对灰葡萄孢的抑菌活性

采用离体、活体试验研究了丝瓜伤流液对灰葡萄孢的抑制活性。结果表明 ,丝瓜伤流液能明显抑制灰葡萄孢的生长、产孢和侵染致病 ;加热 80℃以下抑菌活性稳定 ,室温下保存 1年以上抑菌效果仍很明显。

不同抗性型灰葡萄孢菌Botrytis cinerea对不同作用机制杀菌剂的敏感性研究

不同类型杀菌剂对灰葡萄孢菌菌株的离体、活体毒力测定结果表明 ,苯并咪唑类的多菌灵、甲基硫菌灵之间 ,二甲酰亚胺类的腐霉利、异菌脲、菌核净之间表现交互抗性 ;苯并咪唑类和 N -苯氨基甲酸酯类乙霉威表现有负交互抗性趋势。离体测定中 ,对不同类型菌株以吡咯类杀菌剂咯菌腈 (EC50 <0 .0 2 mg/ L )毒力最高 ,其次为嘧啶胺类杀菌剂嘧霉胺和甾醇抑制剂中的戊唑醇、氟硅唑和丙环唑 (EC50 <1mg/ L) ;活体测定表现出与田间效果具有较高的相关性 ,除嘧霉胺的毒力较小 (EC50 >2 0 0 mg/ L) ,咯菌腈以及甾醇抑制剂戊唑醇。