灵仙新苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激和炎症反应的调控及神经细胞凋亡的影响

目的研究灵仙新苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激反应、神经细胞凋亡以及炎症因子的作用。方法45只大鼠分成对照组、模型组(脑缺血再灌注损伤大鼠)、灵仙新苷低剂量组(8 mg/kg)、灵仙新苷中剂量组(16 mg/kg)、灵仙新苷高剂量组(32 mg/kg),每组9只。治疗5 d后,对大鼠进行神经功能评分,TTC染色法检测脑梗死体积,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测脑组织中切割型胱天蛋白酶-3(cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-3,C-Caspase-3)、切割型胱天蛋白酶-9(cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-9,C-Caspase-9)、核因子κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)蛋白水平,二硝基苯肼法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平,比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平,ELISA法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量。结果与对照组比较,模型组大鼠神经功能评分升高(P<0.05),脑梗死体积增加(P<0.05),细胞凋亡指数和C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平升高(P<0.05),LDH、MDA水平升高(P<0.05),SOD、GSH-Px水平降低(P<0.05),IL-1β、TNF-α含量升高(P<0.05),NF-κB p65蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较,灵仙新苷低、中、高剂量组大鼠神经功能评分依次降低(P<0.05),脑梗死体积依次减少(P<0.05),细胞凋亡指数和C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平依次降低(P<0.05),LDH、MDA水平依次降低(P<0.05),SOD、GSH-Px水平依次升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α含量依次降低(P<0.05),NF-κB p65蛋白表达水平依次降低(P<0.05)。结论灵仙新苷能降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激反应水平,减少细胞凋亡因子C-Caspase-3、C-Caspase-9的表达,抑制炎症介质释放,其机制可能与下调NF-κB信号通路有关。

灵仙新苷对膝骨关节炎软骨细胞凋亡和自噬的影响

目的观察灵仙新苷(C-AR)对体外培养的膝骨关节炎(KOA)软骨细胞凋亡及自噬的影响,探讨其改善KOA的作用机制。方法从接受全膝关节置换术的KOA患者软骨组织提取软骨细胞,通过甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定软骨细胞。将细胞分为对照组、模型组和C-AR组,对照组不予干预,模型组和C-AR组采用白细胞介素(IL)-1β诱导24 h构建KOA模型,C-AR组造模前用30μmol/L C-AR预处理1 h。CCK8法检测细胞活力,ELISA检测细胞IL-6和IL-8含量,流式细胞仪检测活性氧(ROS)含量和细胞凋亡率,Western blot检测Bax、Caspase-3、Bcl-2、Beclin1、LC33B蛋白表达,qRT-PCR检测Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表达,免疫荧光检测LCB表达。结果与对照组比较,模型组软骨细胞活力显著降低(P<0.01),IL-6和IL-8含显著增加(P<0.01),ROS含量和细胞凋亡率显著升高(P<0.01),Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01),Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01),Beclin1、LC3B蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值显著降低(P<0.01);与模型组比较,C-AR组软骨细胞活力显著升高(P<0.05),IL-6和IL-8含量显著减少(P<0.05),ROS含量和细胞凋亡率显著降低(P<0.01),Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01),Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01),Beclin1、LC3B蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值显著升高(P<0.01)。结论C-AR可减轻体外培养的KOA软骨细胞炎症反应,降低细胞凋亡率,其机制可能与激活自噬有关。

灵仙新苷在Beagle犬体内的药动学及其绝对生物利用度研究

目的:研究灵仙新苷在Beagle犬体内的药动学和绝对生物利用度。方法:采用四周期交叉设计,即Beagle犬8只,雌雄各半,随机等分为4组,分别采取单剂量静脉注射(0.75mg/kg)及灌胃(7.5、15和30mg/kg)两种给药方式,交叉给药,间隔1周。并于给药后不同时间点取血,采用LC-MS/MS测定血浆中灵仙新苷的浓度,利用DAS 2.0软件估算灵仙新苷在Beagle犬体内的药动学参数,并计算绝对生物利用度。结果:Beagle犬i.g.7.5、15和30mg/kg灵仙新苷后,估算的t1/2分别为(14.3±2.7)、(13.3±1.3)和(13.7±2.4)h,AUC0-36分别为(1.9±1.2)、(4.5±1.9)和(8.0±3.3)μg.h.mL-1,Cmax分别为(0.14±0.08)、(0.27±0.10)和(0.52±0.28)μg/mL。i.v.0.75mg/kg灵仙新苷后,估算的t1/2为(13.3±3.0)h,AUC0-36为(66.2±12.8)μg.h.mL-1。灌胃灵仙新苷在Beagle犬体内的绝对生物利用度分别为0.32%、0.35%和0.30%。结论:口服灵仙新苷后在Beagle犬体内绝对生物利用度很低,其药动学过程在研究剂量范围内是线性的。

灵仙新苷微乳的制备及其初步药效学研究

目的制备均一稳定的灵仙新苷(clematichinenoside,AR)油包水微乳,并初步考察其对佐剂性关节炎原发病变小鼠的治疗作用,为威灵仙中药单体药物制剂的开发提供药效学基础。方法选用卵磷脂和乙醇分别作为表面活性剂和助表面活性剂,油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M 1944Cs)作为油相,AR水溶液为水相,绘制伪三元相图以确定各成分质量比。通过在小鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(CFA)制备佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)模型。以体质量、肿胀率、胸腺与脾脏指数为主要检测指标,并观察小鼠病变部位的组织形态来比较AR微乳与AR溶液及阳性对照药白芍总苷的差异。结果确定Km=1∶1,处方组成为油相50%,混合表面活性剂35%,水相15%,得到AR微乳为澄清的淡黄色溶液,平均粒径为10.7 nm。AR微乳对佐剂性关节炎原发病变小鼠疗效略好于AR溶液,且AR微乳能更好地改善佐剂性关节炎原发病变小鼠的病理形态及病变部位的组织形态。结论 AR皂苷微乳粒径较小,脂溶性强,能够增加药物在体内的生物利用度。这表明微乳作为新的药物剂型具有广泛的应用前景。另一方面由于制剂促进药物吸收的机制并不是单一的,仍需进一步研究。

不同采收期东北铁线莲药材中灵仙新苷的含量变化研究

目的:考察不同采收期东北铁线莲药材中灵仙新苷(Clematichinenoside AR)含量,研究其动态含量变化和最佳采收期。方法:采用色谱柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)柱,流动相:乙腈-水溶液梯度洗脱程序,流速1.0 mL/min,检测波长203 nm,柱温:30℃。结果:灵仙新苷以8月下旬到9月中旬的含量最高。结论:东北铁线莲药材的最佳采收期为8月下旬到9月中旬。

灵仙新苷体外给药对小肠上皮内淋巴细胞功能的调节作用

目的:考察灵仙新苷体外给药对大鼠小肠上皮内淋巴细胞(IEL)功能的调节作用,并初步探讨其作用机制。方法:通过体外培养大鼠IEL,测定灵仙新苷对IEL的细胞毒性作用以及ConA、LPS分别诱导的IEL培养上清液中TNF-α及IFN-γ含量。结果:灵仙新苷高浓度组(5.5×10-6mol·L-1)可以显著抑制ConA、LPS分别诱导的IEL培养上清液中TNF-α及IFN-γ的含量。灵仙新苷中(5.5×10-7mol·L-1)、低(5.5×10-8mol·L-1)浓度组对IEL的细胞活性没有显著性影响。结论:灵仙新苷对大鼠小肠上皮内淋巴细胞功能具有较明显的调节作用,机制可能与抑制TNF-α和IFN-γ的水平有关。

在体肠灌流模型研究灵仙新苷的大鼠肠吸收特性

目的:研究灵仙新苷在大鼠肠段的吸收特征。方法:以酚红为标示物,采用在体单向肠灌流模型,LC-MS/MS测定灵仙新苷在体肠灌流的浓度变化,研究灵仙新苷的吸收部位和吸收动力学特征。结果:灵仙新苷在大鼠小肠各肠段的吸收速率常数(Ka)、有效渗透系数(Peff)是十二指肠>空肠≈回肠,且十二指肠的Ka和Peff值与其他肠段存在显著性差异(P<0.05);灌流液中同一肠段不同浓度灵仙新苷的Ka和Peff均无统计学显著差异;盐酸维拉帕米和环孢素A均显著性降低对灵仙新苷的吸收(P<0.05)。结论:灵仙新苷在小肠有不同程度的吸收,其中在十二指肠吸收最好,药物浓度对灵仙新苷的Peff和Ka值无影响,其吸收机制为被动扩散,灵仙新苷可能不是P-糖蛋白底物。

灵仙新苷镇痛抗炎作用的实验研究

目的:观察灵仙新苷(AR)的镇痛、抗炎作用。方法:通过扭体法和热板法致小鼠实验性疼痛模型,观察AR的镇痛作用;采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型观察该药的非特异性抗炎作用;通过大鼠足跖皮内注射Freunds完全佐剂模型观察该药对大鼠佐剂性关节炎的继发病变的影响。结果:AR高、中、低剂量组、阿司匹林组和白芍总苷组可显著减少醋酸所致疼痛小鼠的扭体次数;其中AR高、中剂量组和阿司匹林组可显著延长疼痛小鼠扭体潜伏期。吗啡组、AR高、中、低剂量组以及白芍总苷组于给药后可不同程度提高热板模型小鼠的痛阈值。AR各组以及阿司匹林和白芍总苷组皆可显著抑制由二甲苯引起的小鼠耳肿胀。AR高、中、低各剂量组以及阿司匹林和白芍总苷组可显著抑制棉球所致肉芽组织的增生。AR高、中、低剂量组以及环磷酰胺和白芍总苷对弗氏佐剂引起的大鼠免疫性炎症的继发病变有显著治疗作用。结论:AR有较强的抗炎镇痛作用,并呈现一定的剂量相关性。

外翻肠囊法研究灵仙新苷肠吸收动力学

目的:建立外翻肠囊模型测定灵仙新苷浓度,并研究其在大鼠小肠的吸收特征。方法:采用离体肠外翻模型进行肠吸收实验,串联质谱法测定灵仙新苷的含量,研究灵仙新苷在大鼠小肠的吸收部位和吸收机制。计算灵仙新苷的累计吸收量(Q)和吸收速率(J)。结果:灵仙新苷在大鼠的十二指肠、空肠和回肠均可进人肠囊(P>0.05),且浓度在检测的线性范围内;肠囊内灵仙新苷的Ka具有明显的浓度依赖关系,未观察到饱和现象;P-糖蛋白抑制剂维拉帕米未见对灵仙新苷的小肠吸收产生显著性影响。结论:灵仙新苷在大鼠小肠的不同肠段均有较好的吸收,吸收机制为被动转运。

灵仙新苷对动脉粥样硬化大鼠血脂的调节和CD36、VCAM-1表达的影响

目的:研究灵仙新苷对动脉粥样硬化模型大鼠血脂的调节以及血管内皮细胞CD36、VCAM-1表达的影响。方法:SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、辛伐他汀组(5 mg/kg)、灵仙新苷高剂量组(32 mg/kg)、灵仙新苷中剂量组(16 mg/kg)、灵仙新苷低剂量组(8 mg/kg)组。采用喂食高脂饲料及第1天一次性腹腔注射维生素D3复制大鼠动脉粥样硬化模型;造模第4周给予阳性药及受试药物,造模第12周大鼠眼眶取血,血清样本用于测定大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL),氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)水平。免疫组织化学法检测大鼠胸主动脉血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)和CD36的表达。结果:灵仙新苷能显著降低动脉粥样硬化大鼠血清TC、TG、LDL和ox-LDL水平,同时灵仙新苷能显著升高动脉粥样硬化大鼠血清HDL水平。免疫组织化学法结果显示灵仙新苷能够降低大鼠主动脉壁内皮细胞粘附分子(VCAM-1)和CD36的表达。结论:灵仙新苷能够有效调节动脉粥样硬化模型大鼠的血脂水平,减轻模型体内的氧化应激;灵仙新苷能够抑制VCAM-1介导的单核细胞与血管内皮细胞的粘附以及清道夫受体(CD36)介导巨噬细胞的内吞作用,灵仙新苷能有效抑制泡沫细胞的形成;灵仙新苷对动脉粥样硬化模型大鼠血脂的调节和抑制VCAM-1和CD36的表达对抑制动脉粥样硬化早期的动脉斑块形成有重要意义。

灵仙新苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

目的考察灵仙新苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护作用,并阐述可能的作用机制。方法 SD大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、丹参酮IIA(阳性药,16 mg/kg)组和灵仙新苷低、中、高(8、16、32 mg/kg)组,连续ig给药7 d;采用结扎冠状动脉左前降支法制备大鼠MIRI模型,缺血40 min再灌120 min;试剂盒法检测MIRI大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)水平;TTC染色法检测心肌梗死率,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率;Western blotting法检测心肌组织中Bcl-2、Bax、TNF-α及Caspase-3的蛋白表达水平。结果与模型组比较,灵仙新苷(8、16、32 mg/kg)显著降低MIRI模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平,心肌梗死率和心肌细胞凋亡率;明显上调Bcl-2蛋白表达水平,下调Bax、TNF-α、Caspase-3蛋白表达水平,且均具有显著性差异(P<0.05、0.01)。结论灵仙新苷对MIRI大鼠心肌具有保护作用,其机制可能与抑制TNF-α,调节Bcl-2/Bax蛋白平衡,减少MIRI诱导的心肌细胞凋亡有关。