炭疽保护性抗原受体结合区的关键氨基酸位点分析

目的分析炭疽毒素保护性抗原(PA)受体结合区与其功能相关的关键氨基酸位点。方法通过定点突变的方法将PA的Asp683分别突变成为一系列带有不同电荷以及不同长度侧链的氨基酸,通过细胞毒性实验分别探询电荷及立体结构对其活性的影响。同时对Asp683的一些邻近氨基酸进行了定点突变的研究。结果细胞毒性实验显示,不同的突变导致了PA活性不同程度的下降,其中Asp683电荷的改变对其活性的影响尤为明显,但当它突变为不带电荷的氨基酸时,PA仍然保留了一定的活性;而当Asp683突变为带正电的Lys后,PA却保留了相对较高的活性。结论Asp683所带的负电荷在PA与其受体的相互作用中起着关键的作用,但PA与其受体之间的相互作用可能还通过一些其他方式进行。

炭疽保护性抗原与炭疽毒素受体结合特征分析

目的:建立检测炭疽毒素保护性抗原(PA)与靶细胞受体(ATR)结合能力的Binding-ELISA方法,并对两者结合特征进行分析。方法:以ELISA实验为基础,建立PA与ATR结合的体外模型,并对实验中的反应条件进行优化。采用Binding-ELISA方法,通过测定不同包被蛋白、不同二价阳离子条件下的D450以及相对饱和度等参数,分析PA与两种ATR的结合特征。结果与结论:以重组PA作为包被抗原时灵敏度更高,包被浓度为2μg/ml;二价阳离子浓度为5 mmol/L。两种受体与PA的亲和力不同,其中CMG2与PA的结合能力更强;并且两者与PA结合时离子依赖特征不同,PA与TEM8的结合能力在Mn2+存在时最强,PA与CMG2的结合能力在Ca2+存在时最强。这一结果与国外报道相符,进一步说明Binding-ELISA方法用于定性分析炭疽毒素与其受体结合能力的可行性,为评价以抑制PA与ATR结合为靶点的毒素抑制剂提供了有效的手段。

炭疽杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用基因重组技术获取炭疽杆菌保护性抗原(PA)。将炭疽杆菌保护性抗原编码基因pag与pET载体连接构建重组质粒,转化大肠杆菌DE3株,诱导表达炭疽杆菌保护性抗原,并经亲和层析及凝胶过滤纯化此抗原。实验成功构建了表达炭疽杆菌保护性抗原的重组菌株,纯化后PA纯度达90%,且经检测纯化产物具有天然PA的生物学活性。同时表明从大肠杆菌中纯化PA较以往从炭疽杆菌中获取PA简便易行。

炭疽毒素保护性抗原和LFn介导的增强型绿色荧光蛋白进入HeLa细胞的研究

目的研究炭疽毒素保护性抗原（protective antigen，PA）和致死因子（lethal factor，LF）N端254个氨基酸（LFn）在辅助增强型绿包荧光蛋白（EGFP）进入细胞中的作用。方法分别扩增炭疽毒素的基因片段和EGFP的基因全长，将两片段先后克隆至pET-21a（＋），构建成重组表达质粒pET-LFn-EGFP，在大肠杆菌中诱导表达，并对融合蛋白LFn-EGFP进行纯化。利用荧光共聚焦显微镜和流式细胞术研究LFn-EGFP融合蛋白进入细胞的情况。结果获得较高纯度的融合蛋白LFn-EG-FP，纯度可达90％以上，体外实验显示该融合蛋白保留了LFn与PA结合的活性，并且能够进入到HeLa细胞中。结论LFn-EGFP蛋白本身电会以未知的机制进入细胞，在PA辅助时，LFn-EGFP进入细胞的效率会有所增加。