炭疽毒素受体2表达受miR-145-5p调控在胰腺癌的作用机制研究

目的:探讨炭疽毒素受体2(anthrax toxin receptor 2,ANTXR2)在胰腺癌组织和细胞中的表达、临床意义和细胞功能,验证miR-145-5p在胰腺癌细胞中调控ANTXR2的作用机制。方法:分析GEO和TCGA数据库中胰腺癌的转录数据和临床数据。通过CCK-8实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验进行细胞功能验证。采用miRNA靶点预测数据库反向预测可能通过ceRNA机制抑制ANTXR2表达的miRNA,并使用双荧光素酶报告实验进行验证。结果:ANTXR2在胰腺癌组织和细胞中的表达均上调(均P<0.05),ANTXR2上调预示着原发肿瘤等级(P<0.05)、肿瘤细胞分化等级(P<0.05)和总体生存期(P<0.05,HR=1.72)均较差。ANTXR2可以促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭(均P<0.05)。ANTXR2是miR-145-5p下游的靶标(P<0.01),miR-145-5p可以通过抑制ANTXR2的表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。结论:ANTXR2在胰腺癌组织和细胞中过表达,促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,且与患者预后有关。miR-145-5p通过调控ANTXR2的表达抑制其促癌作用。

炭疽毒素的细胞受体

炭疽杆菌外毒素是三组分蛋白质 ,构成两种毒素。水肿因子 (EF)和致死因子 (LF)分别是腺苷环化酶和金属蛋白酶 ,保护性抗原 (PA)与细胞表面受体结合并将水肿因子或致死因子转移进细胞内发挥毒性作用。在哺乳动物细胞上己发现有两种受体 ,分别是肿瘤内皮标志 8基因编码的细胞表面蛋白ATR/TEM8和毛细血管形态发生基因 2编码的细胞表面蛋白CMG2。这两种受体蛋白的生理功能都不十分清楚 ,它们之间的氨基酸序列有很高的同源性 (4 0 %～ 6 0 % )。氨基酸序列主要分信号肽、细胞外主基、跨膜区、脑浆尾四个区 ,细胞外主基内含vonWillebrand因子A主基或称整合素插入主基 (VWA/I主基 ) ,VWA/I主基内有金属离子依赖性粘连位点 (MIDAS) ,是主基与PA蛋白质相互作用所必不可少的。这两种受体都有几种异构体 ,主要差异在于胞浆尾区的氨基酸长度不同。两种VWA/I主基都有封闭PA功能 ,阻止细胞中毒的作用 。

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR-Fc在CHO细胞中的表达

ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。

炭疽毒素受体胞外区在毕赤酵母中分泌表达、纯化与活性鉴定

使用分泌型表达载体,实现了重组炭疽毒素受体胞外区(rATR(CMG2)-EXCELL)在毕赤酵母KM71H培养物上清中的分泌表达.表达量约占培养物上清总蛋白质的20%.经过螯合柱初步纯化,每升诱导培养物可获得约1mg电泳纯的rATR(CMG2)-EXCELL.体外与配基PA结合试验和细胞保护试验显示,rATR(CMG2)-EXCELL具有很好的生物活性.rATR(CMG2)-EXCELL的成功表达为今后研究炭疽毒素受体的作用机理、发展新型炭疽治疗药物打下基础.

炭疽毒素受体ATRcDNA的合成和克隆及ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体的构建

可溶性炭疽毒素受体(sATR)可以特异性结合炭疽毒素保护抗原(PA),为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物,构建了表达ATRFc抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为681bp的编码炭疽毒素受体N端1～227氨基酸的基因分成长约50～60碱基的18个寡核苷酸片段,相邻片段重叠部分为20～22个碱基,利用重叠延伸PCR和引物PCR法,将合成的片段组装与扩增,得到了含有ATR1～227的全部编码区和HindIII、BamHI位点在内的DNA片段。回收的基因片段经BamHI/HindIII双酶切连接到pUC19质粒中,挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定,获得了全序列正确的克隆。将ATR基因与Fc基因连接后插入pcDNA3.1载体多克隆位点HindIII和NotI之间,得到表达ATRFc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATRFc,为利用CHO哺乳动物细胞表达ATRFc并研究其生物学性质奠定了基础。

炭疽毒素及其克隆受体的研究进展

综述炭疽毒素研究的最新进展 .炭疽毒素由 3种蛋白组成 :致死因子 (Lethalfactor,LF) ,水肿因子 (edemafactor,EF)和保护性抗原 (protectiveantigen ,PA) .本文主要讲述了炭疽毒素的关键致病因子———致死因子 (LF)的结构和功能 ,炭疽毒素受体 (anthraxtoxinreceptor,ATR)的结构及其特征性功能基团 ,介绍了通过基因互补对ATR进行克隆的方法 。

炭疽毒素受体单克隆抗体的制备、鉴定及结合位点分析

【目的】制备与鉴定针对两种炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor,ATR)的特异性单克隆抗体,为建立ATR的检测方法、研究炭疽毒素的致病机理提供工具。【方法】以重组表达的两种ATR即毛细血管形态发生蛋白2(capkllary morphogenesis protein 2,CMG2)和肿瘤内皮标志8蛋白(tumor endothelial marker 8,TEM8)分别免疫小鼠,制备单克隆抗体,用ELISA、Western dot blotting及细胞保护性试验等方法对所制备的单克隆抗体进行鉴定和分析,并尝试应用上述单克隆抗体经双抗体夹心ELISA、Western blotting和IFA对ATR进行检测。【结果】获得针对CMG2的单克隆抗体4B5、4G3;针对TEM8的单克隆抗体2D6、4B9;以及可同时结合CMG2和TEM8的单克隆抗体2G4,其中4B5具有一定的细胞保护活性,这些单克隆抗体可用于ATR的特异性检测。【结论】本研究所制备的单克隆抗体可经ELISA、Western blotting和IFA用于ATR体内外检测,从而为探讨炭疽毒素的致病机理提供有效的研究手段。

炭疽毒素及其细胞受体的研究进展

炭疽毒素由 3种蛋白组成 :保护性抗原 (protectiveantigen ,PA)、致死因子 (lethalfactor,LF)和水肿因子 (edemafactor ,EF) .综述炭疽毒素研究的最新进展 .主要介绍炭疽毒素的关键致病因子———LF的结构与功能 ,炭疽毒素膜转运成分PA的结构及其受体 (anthraxtoxinreceptor ,ATR)和其cDNA克隆的结构 ,并讨论了在炭疽的治疗、预防和毒素在肿瘤治疗中的可能应用 .

炭疽毒素小分子抑制剂

炭疽病是由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)引起的恶性传染病,炭疽菌进入宿主后产生的炭疽毒素是感染者致死的主要原因。炭疽毒素含有2种具有酶催化活性的蛋白质——致死因子和水肿因子,以及1种共同的结合和转运蛋白质——炭疽保护性抗原,炭疽保护性抗原分别与上述两种因子组成致死毒素和水肿毒素。现阶段治疗炭疽病的主要药物为抗生素,但抗生素只能杀灭人体组织内的部分炭疽热孢子和细菌,不能抵抗孢子和细菌在体内产生的毒素,因而需要开发抑制炭疽毒素的新型药物。本文主要综述近年来国际上对靶向保护性抗原、致死因子和水肿因子的炭疽毒素小分子抑制剂的主要研究进展。

炭疽毒素受体CMG2胞外区的截短表达、纯化及鉴定分析

【目的】分析CMG2胞外区的分子结构与功能,探讨ATR与PA结合的活性位点及特征,为阐明炭疽毒素的致病机理提供依据。【方法】用pQE30表达质粒在大肠杆菌内表达长短不同的3个CMG2胞外区截短片段,经纯化后,用Western blotting和细胞保护性实验对3个重组蛋白进行分析。【结果】发现3个重组蛋白均可与4B5单抗结合,但均没有细胞保护活性。【结论】3个截短蛋白失去了与PA结合的能力,说明CMG2的187～217之间氨基酸残基对PA结合很重要,不可或缺。

炭疽毒素及炭疽防治研究进展

本文介绍了炭疽毒素结构 ,其中主要是水肿因子的结构 ,以及目前在研究炭疽防治新方法方面的最新进展 .水肿因子EF是炭疽毒素的一种成分 ,它是一种腺苷酸环化酶 ,由被钙调蛋白激活 .目前 。

炭疽毒素保护性抗原第四结构域在大肠杆菌中的可溶性表达

人工优化设计并合成炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并与噬菌体gⅢ蛋白N端结构域基因融合,在大肠杆菌中可溶性表达融合蛋白。结果表明合成了炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并在大肠杆菌中获得了高效可溶性融合表达,可溶性表达产物占细菌总蛋白量的36%左右;经亲和层析纯化获得了重组蛋白;Western印迹分析表明,表达产物能与His单抗(重组蛋白羧基端带有6×His)发生特异性结合反应。以上结果表明获得了炭疽毒素保护性抗原第四结构域,为利用人抗体库进行筛选抗炭疽毒素的人源性中和抗体奠定了基础。

抗炭疽毒素的小分子药物研究进展

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的一种人畜共患烈性传染病。炭疽菌主要通过释放炭疽毒素使宿主致病。炭疽毒素包括致死毒素和水肿毒素,这两种毒素是使炭疽感染者死亡的主要因素。该文综述了抗炭疽毒素小分子药物的研究进展。

炭疽毒素保护性抗原的不同结构域对其表达可溶性的影响

目的:对炭疽毒素保护性抗原(PA)的不同结构域进行了缺失突变,以期找到免疫原性降低而功能变化不大的PA蛋白突变体。方法:在对PA结构域的缺失突变体进行表达时,意外发现不同的突变体表达效果之间存在很大差异,遂用DNAStar软件对PA的4个结构域和突变体进行分析。结果:PA蛋白结构域2的表面特性与其他结构域存在很大差异。结论:推断这种表面特性影响了PA突变体的可溶性特征。

慢病毒介导炭疽毒素受体1基因靶向沉默对γ珠蛋白基因表达的影响

目的探讨沉默炭疽毒素受体1 (anthrax toxin receptor 1,ANTXR1)基因对γ珠蛋白基因表达的影响。方法构建ANTXR1基因特异性序列的shRNA重组质粒及阴性对照重组质粒,经酶切验证及测序鉴定后,将干扰载体和慢病毒质粒共转染入293T细胞后收集病毒上清液,再将其转染至K562细胞中,并经puromycin筛选稳转细胞株。通过实时荧光定量PCR技术检测各组ANTXR1基因和γ珠蛋白基因mRNA的表达情况;通过Western蛋白印迹技术检测各组ANTXR1蛋白和γ珠蛋白的表达情况。采用t检验进行统计分析。结果获得有效干扰ANTXR1基因的K562稳转细胞株,实时荧光定量PCR结果显示,ANTXR1-shRNA实验组中ANTXR1基因和γ珠蛋白基因mRNA相对表达水平分别为0.19±0.02和1.46±0.24;Western蛋白印迹技术结果显示,蛋白相对表达水平分别为0.20±0.01和1.45±0.14。ANTXR1-shRNA实验组与阴性对照组、空质粒载体组和空白对照组相比,ANTXR1基因相对低表达,γ珠蛋白基因相对高表达,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论靶向沉默ANTXR1基因后,促进γ珠蛋白基因mRNA和蛋白水平的表达。

炭疽毒素调节痛觉信号并运送分子物质到ANTXR2^(+)背根神经节感觉神经元

细菌产物可作用于神经元而改变其信号传导和功能。该研究发现背根神经节(DRG)感觉神经元富含ANTXR2—一种炭疽毒素的高亲和力受体。炭疽毒素由可与NATXR2结合的保护性抗原(PA)、以及水肿因子(EF)和致死因子(LF)组成。小鼠鞘内注射水肿毒素(ET=PA^(+)EF)作用于DRG神经元而产生镇痛效应。ET可抑制机械感觉和热感觉,以及福尔马林、角叉菜胶或神经损伤诱发的痛敏,其镇痛作用依赖于Na_(v)1.8^(+)或Advillin^(+)神经元上表达的ANTXR2受体。ET可调控小鼠感觉神经元和人源多能干细胞感觉神经元内的蛋白激酶A(PKA)通路,并减弱脊神经传导。炭疽毒素经进一步编辑,使其可携带包括肉毒毒素等外源蛋白物质进入DRG神经元而产生镇痛作用。该研究主要发现了细菌毒素和伤害感受器之间的相互作用,有助于开发镇痛新技术。

炭疽毒素水肿因子对兔多形核白细胞功能的影响

本文报告了观察炭疽毒素EF和PA组分对兔PMN的作用。结果表明,EF和PA共同作用可使细胞内cAMP浓度增高20倍。兔全血和PMN的化学发光强度降低73.5％和68.1％,作用30min后抑制作用即达峰值。单独EF或PA作用未观察到上述观象,提示EF和PA干扰兔PMN的吞噬、杀菌功能。