慢病毒介导炭疽毒素受体1基因靶向沉默对γ珠蛋白基因表达的影响

目的探讨沉默炭疽毒素受体1 (anthrax toxin receptor 1,ANTXR1)基因对γ珠蛋白基因表达的影响。方法构建ANTXR1基因特异性序列的shRNA重组质粒及阴性对照重组质粒,经酶切验证及测序鉴定后,将干扰载体和慢病毒质粒共转染入293T细胞后收集病毒上清液,再将其转染至K562细胞中,并经puromycin筛选稳转细胞株。通过实时荧光定量PCR技术检测各组ANTXR1基因和γ珠蛋白基因mRNA的表达情况;通过Western蛋白印迹技术检测各组ANTXR1蛋白和γ珠蛋白的表达情况。采用t检验进行统计分析。结果获得有效干扰ANTXR1基因的K562稳转细胞株,实时荧光定量PCR结果显示,ANTXR1-shRNA实验组中ANTXR1基因和γ珠蛋白基因mRNA相对表达水平分别为0.19±0.02和1.46±0.24;Western蛋白印迹技术结果显示,蛋白相对表达水平分别为0.20±0.01和1.45±0.14。ANTXR1-shRNA实验组与阴性对照组、空质粒载体组和空白对照组相比,ANTXR1基因相对低表达,γ珠蛋白基因相对高表达,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论靶向沉默ANTXR1基因后,促进γ珠蛋白基因mRNA和蛋白水平的表达。

炭疽毒素受体1蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨炭疽毒素受体1(anthrax toxin receptor 1,ANTXR1)蛋白在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中的表达情况及意义。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)技术和免疫组织化学法检测ESCC和相应癌旁正常组织中ANTXR1蛋白的表达水平,分析其表达与患者临床病理各参数的关系。结果在10对新鲜食管癌组织中,mRNA水平检测ANTXR1在ESCC组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.01);在172例石蜡标本中,ANTXR1蛋白在ESCC组织的阳性表达率明显高于癌旁正常组织,且ANTXR1蛋白的表达与ESCC组织分化程度、有无淋巴结转移、肿瘤分期以及患者的预后相关(P<0.05),与患者的年龄、性别、肿瘤大小和肿瘤的浸润深度无相关性(P>0.05)。结论 ANTXR1蛋白在ESCC组织中高表达,并且与患者的预后相关;ANTXR1蛋白可能是新的ESCC促癌因子,参与ESCC发生、发展,并有望为ESCC的预后判断和治疗提供新的思路。

ANTXR1在压力促BMSCs细胞膜片成软骨响应中作用的研究

目的寻找修复关节软骨的方法一直是临床难题,近年来软骨组织工程研究成为一个新的突破口,大量研究表明适宜的力学刺激可以促进BMSCs向成软骨方向分化,为了研究其中的力学信号转导机制,本实验将探究与整合素有很多相似性的Ⅰ型跨膜蛋白ANTXR1在压力促BMSCs细胞膜片成软骨分化中所发挥的作用。方法首先对BMSCs细胞膜片加以压力刺激,检测ANTXR1、Integrinβ1以及成软骨指标Sox9、Aggrecan和Col-Ⅱ的基因和蛋白表达量。之后用慢病毒构建出下调ANTXR1的BMSCs细胞膜片,采用免疫共沉淀、免疫荧光共定位等技术检测细胞中ANTXR1与Integrinβ1之间相互关系并初步探索ANTXR1下游信号转导分子。结果 120 kPa、1 h的压力刺激能同时上调BMSCs细胞膜片中ANTXR1基因和蛋白表达量的同时促进其成软骨指标的基因和蛋白表达量升高。ANTXR1可与LRP5/6直接结合并产生相互关系,而Integrinβ1的信号通路启动完全不通过LRP5/6。ANTXR1与Integrinβ1具有一定相互联系但是二者并不影响对方在压力刺激下的表达上调。F-actin和其结合蛋白Fscn1可与ANTXR1直接结合而通过构型变化及应力纤维重组参与经ANTXR1的力学信号转导过程。Smad2、Smad4、GSK3β及3-catenin也是ANTXR1的下游信号分子,而这4种信号分子并不与ANTXR1发生直接结合的相互关系,也并不参与基于Integrinβ1的力学信号转导过程。结论 ANTXR1是一种全新的细胞膜力学信号感受分子其在压力促BMSCs细胞膜片成软骨响应中的起到重要作用,而且其在压力下激活并调控压力促BMSCs成软骨分化的功能独立于经典力学信号分子Integrinβ1。

RNA干扰沉默ANTXR1基因对食管癌ECA109细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨RNA干扰靶向抑制炭疽毒素受体1(anthrax toxin receptor 1,ANTXR1)基因的表达对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)ECA109细胞增殖和凋亡的影响。方法利用ANTXR1siRNA转染ESCC ECA109细胞,通过实时荧光定量-聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测转染ANTXR1 siRNA后ESCC ECA109细胞中ANTXR1的表达。利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、平板克隆形成实验和流式细胞术分别检测下调ANTXR1基因的表达对ECA109细胞增殖和凋亡的影响。结果转染ANTXR1 siRNA后,ANTXR1基因在ESCC ECA109细胞中的表达明显下调(P<0.01)。CCK-8检测显示ANTXR1 siRNA组在转染3、4、5 d ECA109细胞的增殖均明显受到抑制,平板克隆形成实验显示实验组的克隆数明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(65.90%±6.87%)高于阴性对照组(40.17%±4.73%),组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。转染48 h后,实验组细胞早期凋亡率(22.61%±3.49%)显著高于对照组的早期凋亡率(8.12%±1.35%)(P<0.01)。结论 ANTXR1基因可能在ESCC ECA109细胞的增殖和凋亡中发挥重要作用,推测ANTXR1基因可能成为治疗ESCC的新靶点。

ANTXR1对人食管癌ECA109细胞株迁移和侵袭能力的影响

目的研究炭疽毒素受体1(anthrax toxin receptor 1,ANTXR1)对食管癌细胞系ECA109的迁移及侵袭能力的影响及机制。方法采用化学合成ANTXR1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)下调该基因表达,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blot检测转染后的细胞内ANTXR1、基质金属蛋白酶2(matirx metallo-proteinases 2,MMP 2)和基质金属蛋白酶9(matirx metallo-proteinases 9,MMP9)的表达,通过细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测ANTXR1对ECA109细胞迁移和侵袭的影响。结果将ANTXR1转染入ECA109后,细胞中ANTXR1 m RNA和蛋白水平都明显降低,MMP2、MMP9表达明显下调,ECA109细胞的迁移和侵袭能力显著降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论在食管癌细胞系ECA109中ANTXR1与细胞的迁移和侵袭能力相关,ANTXR1可能通过影响MMP2和MMP9的表达参与其中,有望成为食管癌早期诊断、分子治疗的靶点。