一种荧光碳点R-CDs对炭疽芽孢杆菌标志物的响应检测

采用简单的水解法制备荧光探针R-CDs,高灵敏、可视化地现场检测炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)孢子标志物,探索一种荧光碳点R-CDs对炭疽芽孢杆菌标志物的响应检测方法。结果显示,该方法可以保持较好的线性关系,线性相关系数r为0.995 4和0.994 9;利用3σ/k计算方法的检出限(LOD)为48.40 nmol/L。建立了一套操作简便、切实可行的炭疽快速检测技术,能够及时发现问题,有效提高国家进出口制品安全质量,保障人民身体健康,同时具有功能多样化、高效化、应用广泛化等优点,该技术成果转化性强,应用价值和利润值较高,市场推广前景广阔。

基于荧光增强现象用于炭疽芽孢杆菌生物标志物DPA的检测

以柠檬酸和六水合硝酸铕为原料,采用水热法合成了微米级的铕配位聚合物(Europium coordination polymer,Eu-CPs),在0.2 mol/L HCI酸性环境伴随着280 nm紫外光连续照射,且存在炭疽芽孢杆菌生物标志物2,6-吡啶二羧酸(Dipicolinic acid, DPA)的情况下,在390 nm 处产生了新的发射峰,并且该发射峰强度随着光照时间的延长而增加。根据280 nm紫外光照前后390nm处发射峰增强的荧光强度差与DPA浓度之间的线性关系,测得DPA检测范围为1-60 μmol/L,最低检测限为28.16 nmol/L。最后我们将其用来实时监测枯草芽孢杆菌孢子中DPA的释放,得到DPA在孢子内的释放几乎在60分钟内完成。

炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的预测及耐药性与毒力分析

【目的】预测并分析炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的比例、前噬菌体携带抗生素耐药基因与毒力基因的情况,了解并分析炭疽芽孢杆菌前噬菌体对菌株耐药性与毒力的影响,为后续研究与应用炭疽芽孢杆菌前噬菌体提供借鉴。【方法】利用PHASTER在线分析软件预测炭疽芽孢杆菌携带的前噬菌体,采用抗生素耐药基因数据库(comprehensive antibiotic research database,CARD)和毒力因子数据库(virulence factors database,VFDB)预测前噬菌体携带的抗生素耐药基因和毒力因子。【结果】预测到1421条炭疽芽孢杆菌前噬菌体,其中完整型前噬菌体267条,疑似型前噬菌体321条,不完整型前噬菌体833条。每株炭疽芽孢杆菌所携带的全部前噬菌体基因组占其基因组比例为3%~4%。771条前噬菌体携带1075个耐药基因。耐药表型共有29种,分别来自28种不同的耐药家族,涵盖6种抗生素耐药的作用机制。394条前噬菌体编码688个毒力因子,归类为71种毒力基因和52种毒力因子。分析毒力因子可能的宿主菌株来源构成发现,除炭疽芽孢杆菌外,嗜肺军团菌亚种、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等也有较高的结构比例,是毒力因子可能的宿主来源。【结论】炭疽芽孢杆菌普遍携带前噬菌体,但前噬菌体基因组在炭疽芽孢杆菌基因组中所占的比例较低。约54%前噬菌体携带抗生素耐药基因,以膦酸类、β-内酰胺类抗生素等为主。约28%前噬菌体携带毒力基因。前噬菌体在炭疽芽孢杆菌抗生素耐药基因的获取与传递、毒力基因的获得与传播及致病性演变过程中可能发挥着一定作用。

炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202 PA-LF 1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF 1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF 1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(+)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF 1和PA-LF 1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF 1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。

炭疽芽孢DNA适配子结构与长度对亲和力的影响

目的 研究炭疽芽孢适配子结构与长度变化对其与芽孢之间亲和力的影响 .方法 人工合成 f77- 1适配子序列 ,并构建在其 7条突变体序列 ,将这些寡核苷酸序列分别与炭疽芽孢结合 ,利用 TMB显色系统判断读取吸光度 A值 ,确定各序列与芽孢间亲和力大小 ;同时通过核酸序列分析软件包模拟各序列的二级结构 ,推断适配子的结构与亲和力之间的关系 .结果 适配子 f77- 1与突变体中的 f77- 3与芽孢亲和力较好 ,约是突变体中 f77- 4亲和力的 1 1倍 ,二级结构显示 :f77- 1 ,f77- 3都具有茎环或发卡结构 ,且 3'端都有连续 3个G.结论 适配子 5'端的茎环结构和发卡结构是这些寡核苷酸序列与芽孢结合的结构基础 ,3'端的连续 3个

荧光量子点免疫标记法检测炭疽芽孢杆菌

建立了荧光量子点标记-免疫分析技术联用检测炭疽芽孢杆菌的方法。通过抗原抗体反应,结合生物素与亲和素间的特异性相互作用,将QDs特异性标记在炭疽芽孢杆菌上,并利用荧光显微镜和荧光分光光度计进行了验证。采用实验室自制的便携式荧光检测系统对标记QDs的炭疽芽孢杆菌样品进行定量检测。结果表明,在炭疽芽孢杆菌浓度在100～1×106 CFU/mL范围内,相对荧光强度与炭疽芽孢杆菌浓度呈良好的线性关系,相关系数R=0.9554,检测相对标准偏差为2.2%。通过与同菌属其它杆菌对比,证明本方法特异性良好。与传统方法相比,本方法操作简单,检测时间短(1 h),且能实现定量检测,在公共安全等方面有广泛的应用前景。

应用Taq Man荧光PCR定性定量检测炭疽芽孢杆菌

目的 发展一种快速、敏感、特异的检测炭疽芽孢杆菌的方法。方法 应用基于TaqMan荧光探针的实时(real time)PCR技术,针对致病炭疽毒株的两个质粒pXO1、pXO2上的pagA ,cap基因和染色体上的ropB基因设计引物和探针定性、定量检测炭疽芽孢杆菌。构造并应用上述探针的外标对照及pagA的内标对照,采用多重荧光定量PCR技术建立荧光定量方法并发现假阴性;采用UDG抗污染和ROX矫正背景噪音,提高检验能力;用该方法检测炭疽芽孢杆菌疫苗株感染的动物脾脏标本,盲法评价该方法在实际工作的应用。结论 该方法能特异、灵敏、高效地检测炭疽芽孢杆菌,该方法的推广和应用对有效防范炭疽生物恐怖袭击、提高突发事件应对能力、快速诊断具有重要意义。

荧光定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究

目的利用LightCycler建立一种简便、特异的实时荧光定量PCR检测方法,用于炭疽芽孢杆菌的快速检测。方法采用SYBR GreenⅠ随机掺入法,利用本实验室建立的实时荧光定量PCR反应体系,根据炭疽芽孢杆菌荚膜和水肿因子设计引物,同时检测两个毒力相关质粒的存在,检测其灵敏度和特异性,并以盲测试验进行验证;在此基础上鉴定14株炭疽芽孢杆菌,并测试该法检测土壤模拟污染标本的灵敏度,实验中设置内对照以排除假阴性结果的存在。结果炭疽杆菌基因组DNA的检测灵敏度可达每反应体系0.53pg,两个克隆株提取质粒的检测限分别为每反应体系12拷贝、140拷贝;检测14株炭疽芽孢杆菌及29株非炭疽芽孢杆菌的PCR扩增结果表明,炭疽芽孢菌DNA均出现特异的扩增结果,29株对照菌的DNA均为阴性;土壤模拟污染标本检测灵敏度可达每反应体系36个芽孢;20次重复实验结果表明其平均值与标准差为14.602±0.640。结论该方法检测炭疽芽孢杆菌具有简便、快捷、灵敏度高和特异性好的特点,为临床诊断、环境监测、卫生防疫等方面,快速检出炭疽芽孢杆菌提供了有利的手段。

应用荧光PCR检测土壤、脏器中的炭疽芽孢杆菌

目的用荧光定量PCR方法检测土壤、动物脏器和血液中炭疽芽孢杆菌,评价并优选目标核酸纯化方法。方法采用TaqMan荧光定量PCR技术,以炭疽芽孢杆菌pagA、rpoB2引物探针和相应外标、内标为手段,比较4种从土壤中检测炭疽菌及3种从感染脏器及血液中检测炭疽菌的方法,探讨环境和组织样品中抑制因素对荧光定量PCR检测的影响,优选并确定纯化检验手段。结果应用NaI裂解glassmilk纯化炭疽菌核酸并用荧光定量PCR检验,检出底限为2·5万拷贝/g土壤(pagA),从血液样本的检出限为1000拷贝/ml。结论荧光定量PCR技术和NaI裂解glassmilk纯化制备模板的联合应用可灵敏、特异地从土壤、血液中检测炭疽芽孢杆菌。

两起炭疽突发疫情中炭疽芽孢杆菌的分离鉴定

目的 2008年青海省牧区发生2起牧民宰杀病死牛引起的疑似炭疽疫情,采集样品做炭疽杆菌分离鉴定。方法以生化、噬菌体裂解、青霉素敏感等实验对采集的患者标本、动物标本、环境标本的纯培养菌株进行鉴定。结果 2起疫情均从动物标本中检出炭疽芽孢杆菌。结论疫情中炭疽杆菌的检出率同实验室检测技术、送检标本的质量和及时性有密切关系。

PCR方法快速检测炭疽芽孢杆菌

目的 :快速检测炭疽芽孢杆菌。方法 :质粒提取及PCR扩增。结果 :用两对引物扩增 ,阳性样本可分别扩出两条 877bp和 10 89bp左右的条带 ,阴性样本未扩增出。结论 :所采用的方法可快速检测出环境中的炭疽芽孢杆菌 ,并可对其致病性进行评价。

炭疽芽孢杆菌芽孢适配子的结构与亲和性分析

为了对炭疽芽孢杆菌疫苗株A .16R芽孢的适配子进行亲和性分析 ,体外构建了 78个碱基的随机DNA库 ,以炭疽芽孢杆菌疫苗株A .16R芽孢为靶标 ,用SELEX技术进行了 15轮的筛选 ,将筛选到的适配子库进行克隆、测序 ,用Macaw 2 .0 5和DNAsisv2 .5软件对每一适配子的保守序列和二级结构进行分析 ,并用生物素 链酶亲和素 辣根酶系统检测 ,根据OD值的高低判定亲和力的大小 ,对每一适配子进行亲和力测定。结果表明 ,适配子的亲和力高低不一 ,OD值最高为 1.2 ,最低为 0 .2 5 ,二级结构分析结果显示 ,茎环和茎等二级结构可能是适配子与芽孢结合的基础 ;其一级结构提示有AGGGG、CCCCG、GGGTT、ACACT等保守序列 。

炭疽芽孢杆菌的分离鉴定及其与疫苗株的鉴别诊断

目的建立炭疽芽孢杆菌临床分离株和疫苗株的鉴别诊断方法,为炭疽疫情判断和疾病控制提供依据。方法以炭疽芽孢外壁胶原样蛋白的编码基因bclA和pXO1质粒上的aat序列为靶点,设计引物,通过PCR扩增片段多态性和测序结果分析可变串联重复序列(VNTR)。在生物安全3级实验室分离炭疽菌体蛋白,使用MALDL-TOF/TOF质谱仪进行检测,BioTyper软件分析图谱。结果炭疽分离株与Ⅱ号、无荚膜疫苗株,VNTR分析结果均有不同。2个分离株测定bclA基因序列全长均为1 113bp,编码的蛋白包含66个GXX重复和5个BclA重复。质谱分析发现,2个分离株菌体蛋白表达峰图基本一致,而2个疫苗株与之相比有很大的差异,许多蛋白的表达明显下调。结论两种方法都能够有效鉴别炭疽临床分离株和疫苗株。

炭疽芽孢杆菌检测鉴定技术研究进展

炭疽芽孢杆菌的感染 ,无论是自然感染 ,还是作为生物恐怖和生物战的手段 ,快速检验和鉴定炭疽芽孢杆菌是最为关键的 ,只有正确识别生物战剂的种类 ,才能为正确实施防治措施指明方向。本文讨论了炭疽芽孢杆菌的检验鉴定技术 ,包括常规的分离培养、免疫学技术、核酸分析技术、生物传感器、基因芯片技术的应用和新诊断分子 ,如肽核酸与适配子的应用。

突发疫情中炭疽芽孢杆菌的分离及鉴定

对疑似炭疽感染病牛牛肉标本和牛血污染土壤标本进行了病原菌分离,经菌落形态和菌体形态观察、血清学实验和生化鉴定,证明分离到的细菌为炭疽芽孢杆菌。为进一步了解其特性,分别用保护性抗原、水肿因子和荚膜基因特异性引物对2株菌进行PCR扩增。结果显示,这两株菌有两个毒力相关质粒pX01和pX02,为有毒株。序列测定表明,这两株菌基因间同源性达99%,这两株菌与GenBank中炭疽芽孢杆菌A2012株、Ames Ancestor株和A16R疫苗株同源性达99%。

用复合PCR检测炭疽芽孢的研究

目的 建立同时检测炭疽芽孢杆菌两个毒力相关质粒基因的复合PCR技术 ,并用于模拟污染土壤中炭疽芽孢的检测。方法 根据炭疽芽孢杆菌两个毒力相关质粒pX0 1和 pX0 2上的水肿因子和荚膜基因设计引物 ,并探讨建立复合PCR同时扩增这两种基因的方法 ,评价其特异性和敏感性 ,并将炭疽芽孢杆菌疫苗株A16 R的芽孢加入土壤制备污染土壤 ,用复合PCR检测其中的芽孢 ,评价该方法的实用性。结果 我们发现在影响复合PCR的条件中 ,不同引物的比例与浓度条件最为关键 ;复合PCR检测的敏感性比单一基因PCR检测敏感性低 10倍。用复合和单一PCR检测土壤中的炭疽芽孢表明 ,二者都能检测出 0 2 5 g土壤中的 10 3 个芽孢。结论 我们建立的复合PCR能够特异敏感的检测土壤中的炭疽芽孢。

炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株构建

【目的】构建炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株,为研究eag基因的功能奠定了基础。【方法】本研究以我国人用炭疽杆菌活疫苗A16R株中eag基因为目的缺失基因,根据炭疽芽孢杆菌Ames株基因组序列,利用软件设计了扩增上下游同源臂以及抗性基因引物,构建了重组质粒,将该重组质粒电击转入炭疽杆菌A16R感受态细胞中,利用同源重组原理筛选到炭疽杆菌A16R株eag基因缺失突变株。在分子水平及蛋白质组学方面对基因缺失突变株进行验证。【结果】成功构建了重组质粒,经同源重组后获得eag基因缺失突变株。PCR鉴定表明目的基因已经丢失;SDS PAGE表明野生株与突变株在93 kDa处有差异蛋白条带,经质谱鉴定分析该条带为目的基因所表达的EA1蛋白;双向电泳结果显示突变株与野生株比较明显缺失3个蛋白点,经质谱分析后确定这3个点都是EA1蛋白。【结论】成功获得炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株,为深入研究eag基因的功能奠定了基础,同时也为炭疽芽孢杆菌重要基因功能的研究建立了一个良好的技术平台。

炭疽芽孢杆菌噬菌体AP631的生物学特性检测

炭疽病(Anthrax)一直是分布较广、发病率较高的烈性传染病。病原菌的分离和鉴定是诊断炭疽病的关键手段。用特异噬菌体进行炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的鉴别具有快速、准确、简便等优点。董树林等于1963年分离到炭疽芽孢杆菌噬菌体AP631,从60年代就开始用于实验诊断,对其生物学特性曾进行部分研究。但目前对AP631所知甚少。本实验的目的在于为病原学诊断和AP631的进一步利用,提供数据和积累资料。

炭疽芽孢杆菌PA蛋白的表达及免疫保护效果研究

扩增了炭疽芽孢杆菌PA基因,构建了原核表达质粒pET-28a-PA,并对其进行了诱导表达,对表达产物免疫原性和免疫保护效果进行了研究。结果表明,PA基因的长度约为2 205 bp,PA蛋白的相对分子质量为83 ku;rPA蛋白具有良好的免疫原性,初免后10 d即可检测到特异性抗体,第3次免疫后抗体水平明显升高,可达1∶12 800;rPA蛋白刺激小鼠产生的特异性抗体亚型以IgG 1为主;rPA蛋白在体外对小鼠脾脏细胞有促进生长和增殖作用。rPA免疫组小鼠脾脏中CD4+细胞显著增加,免疫应答趋向T h2型反应,说明rPA介导的免疫反应以体液免疫为主。rPA具有一定的免疫保护作用,保护率达到50%。

用MALDI_TOF MS观察适配子与炭疽芽孢的结合反应

用基质辅助激光解吸电离_飞行时间质谱(MALDI_TOFMS)观察炭疽芽孢适配子与炭疽芽孢结合反应 ,将SELEX(systemevolutionofligandsbyexponentialenrichment)技术筛选获得的一个炭疽芽孢适配子F77和第18轮的混合适配子以及兔抗炭疽芽孢抗体分别与炭疽芽孢结合反应后 ,用MALDI_TOFMS指纹图变化来研究这些分子与芽孢的结合情况 ,结果显示抗体、单个和混合适配子与芽孢结合反应后约在m/z1800处产生的质谱峰强度与芽孢对照相比明显降低;用MALDI_TOFMS质谱图变化可以推测适配子与芽孢的结合反应 ,该试验中观察到的结合情况与作者以前的研究结果一致。