神经型烟碱乙酰胆碱受体α7亚单位基因和儿茶酚-O-甲基转移酶基因多态性与精神分裂症的关联研究

目的探讨CHRNA7、COMT基因多态性与精神分裂症的相关关系。方法采用聚合酶链反应及聚丙烯酰胺凝胶芯片技术,检测粤东地区精神分裂症患者(140例)与正常对照者(100例)CHRNA7基因3个单核苷酸多态性位点(rs2337980、rs1909884、rs883473)和COMT基因3个单核苷酸多态性位点(rs4680、rs737865、rs165599),并对分型结果进行测序鉴定。结果所有位点的单核苷多态性与精神分裂症发病风险无关联(均P>0.05)。结论在中国粤东地区CHRNA7基因3个位点(rs2337980、rs1909884、rs883473)和COMT基因3个位点(rs4680、rs737865、rs165599)的基因多态性可能与精神分裂症无关,但此结论尚需要进一步扩大样本量进行验证。

重组乙酰胆碱受体α-亚单位融合蛋白诱导实验性自身免疫性重症肌无力

目的 探讨重组乙酰胆碱受体 (Ach R)的α-亚单位融合蛋白诱导实验性自身免疫性重症肌无力动物模型的可行性 ,从而为重症肌无力的实验研究创造条件。方法 以重组 Ach R的α-亚单位融合蛋白主动免疫L ewis大鼠 ,末次免疫后观察临床表现 ,并进行低频重复电刺激、单纤维肌电图及血清乙酰胆碱受体抗体 (Ach Rab)滴度检测。结果 实验组 5只大鼠有临床症状者 4只 ,主要表现为摄食减少 ,活动减少 ,嘶咬无力且易疲劳 ,其中 1只有明显肌无力 ;实验组 5只大鼠有 3只低频重复电刺激衰减率 >10 % ,其中 1只衰减率 >2 0 % ;实验组大鼠 MCD值较正常组明显延长 (P<0 . 0 1) ,而 CFA对照组与正常组 MCD值无明显差异 (P>0 . 0 5) ;实验组 5只大鼠Ach Rab的 P/ N值 ,有 4只≥ 2 .1,1只介于 1.4和 2 .1之间。结论 以重组 Ach R的α-亚单位融合蛋白主动免疫L

神经型尼古丁乙酰胆碱受体α7亚单位基因多态性与散发性Alzheimer病的关联分析

目的探讨散发性Alzheimer病(SAD)与神经型尼古丁乙酰胆碱受体α7亚单位(CHRNA7)基因多态性的关系。方法用聚合酶链式反应温度梯度凝胶电(PCRTGGE)和DNA测序技术分析16例SAD患者及16名正常人CHRNA7基因全部10个外显子及其两侧的部分内含子序列和内含子4的部分基因序列。结果在CHRNA7基因上发现2个新的多态性位点;内含子3区的133418G/C突变,两组相比差异无显著性(χ2=4.571,P>0.05);内含子7上的117643+GTG三碱基插入突变,两组相比差异无显著性(χ2=1.032,P>0.05)。结论在CHRNA7基因上发现的2个新的多态性位点与SAD的发病无显著相关性。

乙酰胆碱对人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞N受体α亚单位的影响

目的 :了解Ach对人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞烟碱型胆碱能受体 (N受体 )α亚单位数量的影响及两者间的差异。方法 :采用免疫组化法检测培养的人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞膜上N受体α亚单位的数量。结果 :胃腺癌细胞N受体α亚单位数量、数密度明显高于胃粘膜上皮细胞 (P <0 .0 1)。Ach使胃粘膜上皮细胞N受体α亚单位的数目、面密度和数密度增加 (P <0 .0 1) ,却使胃腺癌细胞N受体α亚单位数量及面密度减少 (P <0 .0 1)。结论 :Ach对正常细胞和肿瘤细胞的作用机制可能不同。

乙酰胆碱对人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞N受体γ亚单位的影响

目的 :了解Ach对人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞烟碱型胆碱能受体 (nAchRs)γ亚单位的影响及两者间的差异。方法 :采用免疫组化法检测培养的人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞膜上nAchRsγ亚单位的数量。结果 :Ach使胃粘膜上皮细胞nAchRsγ亚单位的数量、数密度和面密度显著增加 (P <0 .0 1) ,但对胃腺癌细胞nAchRsγ亚单位无影响。结论 :胃粘膜上皮细胞nAchRSs对不同浓度的Ach反应性不同 。

乙酰胆碱对人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞N受体β亚单位的影响

目的:了解乙酰胆碱(ACh)对人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞烟碱型胆碱能受体(N受体)β亚单位的影响及两者间的差异。方法:采用免疫组化法检测培养的人胃粘膜上皮细胞和胃腺癌细胞膜上N受体β亚单位的数量、数密度和面密度的变化。结果:胃腺癌细胞N受体β亚单位数量、数密度明显高于而面密度低于胃粘膜上皮细胞(P<0.05)。10-6mol/L ACh使胃粘膜上皮细胞N受体β亚单位的数目、面密度和数密度增加(P<0.01),该作用未被阿托品阻断。两种浓度的ACh对胃腺癌细胞N受体β亚单位未见显著性影响。结论:低浓度ACh使培养的胃粘膜细胞N受体失敏,但对胃腺癌细胞N受体β亚单位的作用不明显。

重症肌无力B细胞免疫应答涉及乙酰胆碱受体的全部亚单位

用酶联免疫斑点（Ｅｌｉｓｐｏｔ）法计数乙酰胆碱受体（ＡＣｈＲ）及其α－、β－、γ－和δ－４种亚单位的特异性ＩｇＧ抗体分泌细胞，评价重症肌无力（ＭＧ）患者外周血Ｂ细胞免疫应答。与其他神经疾病（ＯＮＤ）组相比，ＭＧ组存在显著高水平的ＡＣｈＲ及其４种亚单位的抗体分泌细胞，ＭＧ组４种ＡＣｈＲ亚单位的抗体分泌细胞平均值为１０／１０５～１５／１０５外周血单个核细胞（ＭＮＣ），ＯＮＤ组为０．６／１０５～１．４／１０５ＭＮＣ（Ｐ＜０．０００１）。ＭＧ组ＡＣｈＲ抗体分泌细胞数总是高于任何一种亚单位抗体分泌细胞数，且对α－亚单位的Ｂ细胞免疫应答占有明显优势，这可能是α－亚单位存在主要免疫源区（ＭＩＲ）的间接证据。

条件免疫对胶原性关节炎大鼠烟碱样乙酰胆碱受体及胆碱乙酰转移酶表达的影响

目的建立条件免疫反应(CIR)模型,研究CIR状态下胶原性关节炎(CIA)大鼠烟碱样乙酰胆碱受体α7亚单位(nAChRα7)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)蛋白和mRNA表达,探讨CIR可能的胆碱能通路作用机制。方法将大鼠分为健康对照组和CIA模型组,模型组大鼠分为5组:CIR组;甲氨蝶呤(MTX)+泼尼松(Pred)治疗组;MTX+Pred治疗减量组;单纯闻樟脑气味组;空白对照组。用免疫组织化学方法和RT-PCR方法检测各组大鼠关节滑膜nAChRα7、ChAT蛋白和mRNA表达。结果免疫组织化学和RT-PCR均显示CIR组关节滑膜nAChRα7、ChAT蛋白和mRNA的表达明显均高于空白对照组(P均<0.01);空白对照组大鼠表达nAChRα7、ChAT明显低于健康对照组和CIR(P均<0.01),而MTX+Pred组、MTX+Pred减量组、单纯闻樟脑气味组均与空白对照组差异无显著性(P均>0.05)。结论CIR状态下nAChRα7、ChAT mRNA和蛋白表达水平增高,表明胆碱能抗炎通路在CIR治疗胶原性关节炎大鼠的作用机制中起重要作用。

多奈哌齐上调海马神经元β2烟碱型乙酰胆碱受体的表达

目的观察多奈哌齐对β淀粉样蛋白25-35片断(Aβ25-35)诱导原代培养的海马神经元损伤的保护作用及神经元β2烟碱型乙酰胆碱受体(β2-nAChR)的表达。方法在不同时间及采用不同浓度多奈哌齐提前干预培养的海马神经元,之后用Aβ25-35诱导神经元损伤。采用倒置显微镜观察神经元形态学改变,以MTT法测量神经元活性变化,利用免疫荧光法观察不同浓度和不同时间多奈哌齐干预后Aβ25-35损伤神经元β2-nAChR表达情况,并用激光扫描共聚焦显微镜免疫荧光半定量法测量其平均相对荧光强度变化。结果多奈哌齐干预组可减轻Aβ25-35对神经元的损伤。多奈哌齐预处理组神经元β2-nAChR表达明显增加,其平均相对荧光强度明显高于Aβ25-35损伤组。结论多奈哌齐对Aβ25-35诱导损伤神经元的保护作用部分与β2-nAChR的上调有关。

甲状腺激素对大鼠脑海马发育期神经元烟碱受体α4亚单位表达的影响

目的探讨甲状腺激素(TH)对发育关键期大鼠脑海马区域神经元烟碱受体α4亚单位(nAChRα4)表达的作用和影响。方法实验分成正常对照组(n=42)和甲减组(n=36)。选用甲巯咪唑(MM)复制甲状腺机能减退大鼠模型,收集出生后第0,4,7,14,21,30,120天的正常、甲减仔鼠脑组织,每组6只。采用原位杂交组织化学法检测发育关键期仔鼠大脑海马区域神经元烟碱受体α4亚单位(nAChRα4)的表达变化情况。结果①正常对照组nAChRα4 mRNA在生后不同发育阶段的表达变化明显且具有层状分布的特点。生后第0天表达很低,在生后第14-21天nAChRα4 mRNA表达最高,然后下降,直至成年鼠水平(生后第120天)。②正常对照组nAChRα4 mRNA海马CA1区阳性信号表达高峰(生后第21天)是成年鼠的4-5倍,海马CA2、CA3区阳性信号表达高峰(生后第21天)是成年鼠的8倍左右,海马齿状回(DG)区阳性信号表达高峰(生后第14天)是成年鼠的5倍左右。③甲减组nAChRα4 mRNA表达在各时点均明显低于正常对照组(P<0.001)。甲减组表达的高峰时间与正常对照组的高峰时间相一致,无高峰延迟。结论在脑发育关键期,甲状腺激素水平的减少改变了大鼠脑海马神经元烟碱受体α4亚单位的表达,进一步影响了该区域突触的发生及相关神经回路的建立,出现神经元的旷置或错误神经通路,这可能阻碍了脑发育与其功能的成熟。

银杏内酯对拟AD模型大鼠海马烟碱型乙酰胆碱能受体表达的影响

目的探讨银杏内酯对拟Alzheimer disease(AD)大鼠学习记忆能力影响的可能机制。方法大鼠海马冈田酸(Okadaic acid,OA)微量注射,银杏内酯灌胃。Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力;Western blot- ting实验检测大鼠海马烟碱型乙酰胆碱能受体的表达;RT-PCR实验检测海马烟碱型乙酰胆碱能受体mRNA的表达。结果与对照组比较,模型组大鼠学习记忆能力明显下降(P<0.01),烟碱型乙酰胆碱能受体表达减少(P<0.05);与模型组相比,银杏内酯组大鼠学习记忆能力明显提高(P<0.01),烟碱型乙酰胆碱能受体表达增多(P<0.05)。各实验组大鼠烟碱型乙酰胆碱能受体α_3亚单位mRNA变化不明显;与对照组相比,模型组大鼠烟碱型乙酰胆碱能受体α_7亚单位mRNA明显增多(P<0.05);与模型组相比,银杏内酯组大鼠烟碱型乙酰胆碱能受体α_7亚单位mRNA减少明显(P<0.05)。结论银杏内酯提高拟AD大鼠的学习记忆能力可能与其在mRNA水平上影响烟碱型乙酰胆碱能受体,从而保护和改善其功能有关。

烟碱型乙酰胆碱受体α3和/或α5型在大鼠脑垂体中的表达:荧光双标免疫组织化学研究

为了探讨在大鼠脑垂体中,包含α3和 /或α5亚单位的烟碱型乙酰胆碱受体(N -AChR)是否存在,我们运用免疫荧光双标记技术对成年雄性大鼠脑垂体进行了研究。结果显示:N -AChR的α3和 /或α5亚单位样免疫反应阳性物质局限性地分布在神经垂体的催产素能神经纤维上,并一直延续到神经垂体的尾侧末端。

α7亚单位的N型乙酰胆碱受体对急性呼吸窘迫综合征小鼠CD11b和炎症因子的影响

目的探讨α7亚单位的N型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptorsα7,α7nAChR)对急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome,ARDS)小鼠CD11b、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的影响。方法健康清洁级雄性Balb/C小鼠40只(6周),完全数字随机分为正常组(N组)、生理盐水对照组(NS组)、ARDS组(A组)、ARDS+段离颈部两侧迷走神经给予乙酰胆碱受体激动剂组(J组),每组各10只正常饲养。用HE染色观察各组小鼠右肺结构,检测肺组织湿重/体质量比值(LWW/DW比值),采用流式细胞仪检测小鼠肺泡灌洗液CD11b的百分比,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测左肺组织IL-1βmRNA、IL-18 mRNA和TNF-αmRNA的表达,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)双抗体夹心法测定各组小鼠血清IL-18含量。结果N组和NS组小鼠右肺HE染色显示结构正常,而A组小鼠肺间质有大量的炎性细胞浸润,肺泡壁增厚、肺泡结构破坏明显,肺泡腔融合。J组小鼠肺泡结构较完整、有少许破损、肺泡腔存在。A组小鼠肺泡灌洗液CD11b百分比高于其他3组,分别与N组、NS组、J组比较差异有统计学意义(P<0.05)。J组小鼠左肺IL-1βmRNA、IL-18 mRNA和TNF-αmRNA的表达分别与N组、NS组、A组比较差异有统计学意义(P<0.05),A组小鼠血清IL-18水平高于其他3组,分别与N组、NS组、J组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论激活α7nAChR可以直接抑制肺组织CD11b的释放,减少炎症因子的集聚;同时还可以直接抑制肺组织炎症因子IL-1βmRNA、IL-18m RNA和TNF-αmRNA的表达和IL-18的释放,从而抑制ARDS的炎症反应,减轻ARDS病理变化。

吸烟及烟碱型乙酰胆碱受体亚单位α5基因rs17486278位点多态性对肺癌的交互作用

目的 探讨在中国男性人群中吸烟、烟碱型乙酰胆碱受体亚单位α5（CHRNA5）基因多态性与肺癌的关联及其交互作用.方法 采用成组病例对照研究设计,收集男性原发性肺癌病例204例,正常健康对照者821例.采用结构式问卷调查社会人口学特征、吸烟行为及健康状况等,采集静脉血检测CHRNA5 SNP位点rs17486278的多态性.应用多因素logistic回归模型分析吸烟、CHRNA5的基因多态性与肺癌的关系及其交互作用.结果 控制潜在混杂因素后,每天吸烟量＞15支者发生肺癌的风险高于不吸烟者（OR=3.49,95％CI：2.29～ 5.32）,未发现CHRNA5上的rs17486278多态性与肺癌有统计学关联.进一步交互作用分析显示,每天吸烟量1～15支并携带rs17486278纯合变异基因型（CC）者对肺癌的发生存在正交互作用（OR=16.13,95％CI：1.27～205.33）.根据rs17486278多态性和吸烟行为进行分层分析,与不吸烟并携带rs17486278野生基因型（AA）者相比,每天吸烟量1～15支并携带纯合变异基因型（CC）者、每天吸烟量＞15支并携带野生基因型（AA）者和每天吸烟量＞15支并携带杂合变异基因型（AC）者发生肺癌风险增高,OR直分别为8.14（95％CI：1.17 ～ 56.56）、3.84（95％CI：1.30～ 11.40）和5.32（95％CI：1.78 ～ 15.93）.结论 在中国男性人群中CHRNA5的基因多态性与吸烟行为对肺癌的发生存在正交互作用.

周围神经损伤再生后肌肉nAChRε亚单位基因表达的变化

目的:建立肌肉内烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR )ε亚单位mRNA表达水平的荧光定量检测方法,观察周围神经损伤后肌肉内nAChRε亚单位mRNA表达的变化。方法:构建克隆载体pMD18 T ε作为定量模板,进行TaqMan实时荧光定量PCR反应,同时测定该法的灵敏性、特异性和重复性。同法检测大鼠股薄肌支配神经损伤修复后不同时间肌肉标本内nAChRε亚单位mRNA表达的变化。结果:用该方法检测nAChRε亚单位mRNA表达,其线性检测范围为6 个数量级,最低检测下限为1×102 拷贝,最高检测上限为1×107 拷贝。大鼠股薄肌支配神经损伤后,与对照组相比ε亚单位mRNA表达的拷贝数先增加后减少,在术后第3 周降到最低后又逐渐增高,但到术后30 周仍处于低水平(P<0.01)。结论:采用Taq Man实时荧光定量RT PCR检测nAChRε亚单位mRNA的表达水平具有灵敏度高、特异性强、重复性好、线性检测范围宽的优点。神经损伤再生的晚期ε亚单位mRNA表达水平较损伤前有所降低。

肌肉游离移植后烟碱型乙酰胆碱受体ε和γ亚单位表达的变化及意义

目的在基因水平上定量的观察肌肉游离移植后冲经肌肉接头烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)ε和γ亚单位基因表达的动态变化情况,探讨移植后肌肉功能减退与nAChRγ和ε亚单位基因变化之间的可能关系。方法以正常Wistar大鼠股薄肌为对照,利用荧光定量RT-PCR的方法分别检测肌肉移植术后不同时间肌肉样本内ε和γ亚单位mRNA的表达。结果肌肉移植后ε和γ亚单位mRNA表达的拷贝数均是先增高后减少。ε亚单位mRNA表达的拷贝数存术后第3周降到最低后又逐渐增高,但到术后晚期仍低于对照组的水平,差异有统计学意义(P<0.05),而γ亚单位mRNA的拷贝数自术后第2周后开始减少,到术后30周时未完全消失,仍保持低水平的表达。结论终板区亚单位基因的表达变化可能与肌肉游离移植后nAChR的数量减少及功能降低有关系。

神经型烟碱乙酰胆碱受体α7亚单位基因多态性与精神分裂症的传递不平衡研究

目的探讨神经型烟碱乙酰胆碱受体订亚单位基因（neuronal nicotinic acetylcholine receptor α7 subunit gene，CHRNA7）多态性与精神分裂症的关系。方法应用聚合酶链反应及聚丙烯酰胺凝胶芯片技术检测129个精神分裂症先证者核心家系CHRNA7基因的rs2337980、rsl909884、rs883473三个单核苷酸多态性，并采用基于单倍型的单倍型相对风险检验（haplotype relative risk，HHRR）、传递不平衡检验（transmission disequilibrium test，TDT）及单倍型分析进行统计。结果（1）HHRR分析结果显示rs2337980位点精神分裂症患者组与虚拟对照组之间等位基因频率差异有统计学意义（P=0．017）；（2）TDT分析发现，rs2337980位点与精神分裂症之间可能存在传递不平衡，杂合子父母过多的传递等位基因C给患病子女（P=0．021）。（3）单倍型分析发现，rs2337980、rsl909884及rs2337980、rsl909884、rs883473组成的单倍型与精神分裂症有显著相关（总体P=0.034；global P=0．027），其中T-C，T-C-T两个单倍型与精神分裂症可能存在传递不平衡。结论CHRNA7基因多态性可能与精神分裂症存在关联，rs2337980的变异等位基因T可能是精神分裂症的保护性因子。

重症肌无力患者肌肉AChR亚单位基因的表达

目的探讨重症肌无力(MG)患者眼外肌易于受累的机制。方法采用RT-PCR对正常人眼外肌、其他骨骼肌群(8例)以及MG患者肋间肌(10例)AChRα、β、γ、ε、δ亚单位mRNA的表达进行分析,同时采用ELISA方法检测83例MG患者血清AChR抗体对不同骨骼肌群AChR的反应。结果①正常人眼外肌与其他骨骼肌一样均可见AChRα、β、γ、ε、δ亚单位mRNA的表达;②全身型MG患者肌肉AChRαP3A+/β-actin较正常对照组高(P=0·028);③眼肌型、全身型MG抗成人腓肠肌AChR抗体显著高于抗胎儿肌肉AChR抗体(P=0·001,0·016)。结论MG患者眼外肌易受累机制可能与眼外肌AChR亚单位mRNA表达水平及眼外肌的内在易感性有关。

烟碱样胆碱能通路对胶原性关节炎大鼠的作用研究

目的探讨烟碱样胆碱能通路对胶原性关节炎(CIA)的作用,为关节炎等自身免疫性疾病寻找新的治疗途径。方法建立大鼠CIA模型,将模型大鼠分为迷走神经刺激(VNS)组和假手术组,VNS组在完全清醒状态下给予持续迷走神经刺激(5v,2ms,1HZ),每天30min,共4周。观察2组大鼠的病理和关节炎指数变化,用免疫组织化学和RT-PCR技术检测大鼠烟碱样乙酰胆碱受体α7亚单位(nAChRα7)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)及乙酰胆碱酯酶(AChE)在关节滑膜的蛋白和基因表达。结果治疗4周后,VNS组大鼠关节炎指数明显低于假手术组(P<0.01);VNS组大鼠踝关节组织病理改善明显高于假手术组(P<0.01);免疫组化和RT-PCR检测nAChRα7、ChAT蛋白和mRNA表达均明显高于假手术组(P<0.01);各组大鼠AChE蛋白和基因水平表达均差异无显著性(P>0.05)。结论电刺激迷走神经可以上调nAChRα7、ChAT基因在免疫组织的表达,减轻胶原性关节炎大鼠的炎症,提示烟碱样胆碱能通路在治疗胶原性关节炎中有重要作用。