尼古丁通过α7亚型烟碱型乙酰胆碱受体影响牙周膜干细胞成骨分化实验研究

目的:探讨尼古丁是否通过α7亚型烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nAChR)影响人牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化潜能。方法:极限稀释法获得PDLSCs。茜素红染色评估细胞分化形成矿化结节的能力。采用实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测成骨相关基因ALP、OCN、BSP、Runx2及其蛋白的表达情况。采用Western blot检测α7 nAChR及其下游通路相关蛋白表达情况。结果:尼古丁以浓度依赖的方式影响PDLSCs成骨分化。尼古丁通过上调α7 nAChR表达进一步激活Wnt/β-catenin信号通路,从而导致PDLSCs成骨分化能力降低。抑制α7 nAChR及阻断Wnt通路能够逆转尼古丁对细胞分化的负性调控作用。结论:尼古丁可通过α7 nAChR抑制PDLSCs成骨分化,这可能是吸烟相关性牙周炎的发病机制之一。

烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型在产后抑郁中的作用机制研究

目的探讨烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(α7nAChR)在产后抑郁(PPD)中的作用机制。方法使用激素模拟妊娠(HSP)诱导的PPD小鼠模型,并将小鼠分为4组对照组、PPD组、PNU282987组和PNU282987+α7nAChR inhibitor组。对小鼠进行悬尾试验和强迫游泳试验以评估抑郁样行为。分别通过Nissl染色和免疫荧光染色检测海马CA1区神经细胞和α7nAChR表达。通过蛋白质印迹分析NLRP3炎症小体激活情况。结果与PPD组相比,PNU282987组鼠海马组织中α7nAChR表达和海马区的神经细胞数量显著增加(P<0.01),和尾悬测试和强迫游泳测试中的不动时间显著降低(P<0.01);PNU282987组小鼠海马组织中NLRP3、NF-κB、pro-IL-1β、cleaved-caspase 1和IL-1β表达较PPD组显著降低(P<0.05);与PNU282987组小鼠相比,PNU282987+α7nAChR inhibitor组小鼠在尾悬测试和强迫游泳测试中的不动时间显著增加(P<0.01),且海马区的神经细胞数量显著降低(P<0.05);此外,α7nAChR inhibitor逆转了PNU282987对PPD小鼠海马组织中NLRP3、NF-κB、pro-IL-1β、cleaved-caspase 1和IL-1β表达的抑制作用(P<0.05)。结论α7nAChR通过抑制NLRP3炎性体激活在PPD中发挥保护作用。

内源性配体SLURP1经α7亚型烟碱型乙酰胆碱受体介导调控乳牙牙髓干细胞破骨能力的研究

目的:初步探讨α7亚型烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nAChR)及其内源性配体SLURP1在乳牙生理性根吸收过程中调控破骨细胞分化成熟的可能作用。方法:分离培养并优选乳牙生理性根吸收不同时期乳牙牙髓干细胞(SHEDs)及恒牙牙髓干细胞(DPSCs),经检测鉴定后,分别采用实时定量PCR、免疫荧光染色及半定量光密度分析技术检测各组细胞中α7 nAChR基因及蛋白的表达差异;实时定量PCR检测各组细胞中SLURP1、经典成骨/破骨相关因子RANKL、OPG基因的表达差异,并进行统计学分析。结果:乳牙牙根吸收中期及晚期的SHEDs中α7 nAChR基因和蛋白的表达水平显著高于乳牙牙根稳定期SHEDs与恒牙DPSCs(P<0.05);SLURP1基因表达水平以乳牙牙根吸收中期最高,晚期次之,恒牙再次之,乳牙牙根稳定期最低,各组间P<0.05。RANKL/OPG比值与SLURP1基因表达趋势一致(P<0.05)。结论:SLURP1与乳牙牙髓干细胞膜上的α7 nAChR结合后,可通过调节RANKL/OPG的表达比例而影响乳牙牙髓干细胞的破骨能力。

大鼠弥漫性轴索损伤后脑干内α7烟碱型乙酰胆碱受体的表达变化

目的探讨弥漫性轴索损伤(DAI)后大鼠脑干内的烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(α7nAChR)的动态变化。方法 50只SD大鼠按随机数字表随机分为正常组、假损伤组、DAI7d组、DAI30d组和DAI90d组,每组10只。正常组立刻处死,假损伤组麻醉且固定于头夹后处死,DAI7d组、DAI30d组与DAI90d组分别于致伤后7、30与90d后处死。取脑干进行免疫组化染色,检测α7nAChR的表达情况,使用IPP软件对α7nAChR进行定量评估。结果正常组、假损伤组与DAI7d组之间α7nAChR的表达无显著性差异。DAI30d组与正常组、假损伤组、DAI7d组相比,α7nAChR表达水平明显降低(P<0.05);而DAI90d组α7nAChR表达水平又明显低于DAI30d组(P<0.05)。结论 DAI可引起大鼠脑干组织中α7nAChR表达的减少。

生理性根吸收过程中乳牙牙髓干细胞通过α7 nAChR调节破骨细胞分化能力的研究

目的:探讨生理性根吸收过程中乳牙牙髓干细胞(DDPSCs)通过α7亚型烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nAChR)对破骨分化能力的调节作用。方法:酶消化法和有限稀释法分离培养根吸收不同时期DDPSCs和恒牙牙髓干细胞(DPSCs)。采用实时定量PCR和Western blot,检测各组细胞α7 nAChR、RANKL、OPG的表达及其比值差异,以及阻断α7 nAChR后RANKL、OPG的表达及其比值变化。结果:α7 nAChR表达及RANKL/OPG比值在根吸收中期DDPSCs中明显升高(P<0.05)。阻断α7nAChR后,RANKL/OPG明显下降(P<0.05)。结论:在乳牙生理性根吸收过程中,α7nAChR通过上调自身表达,参与对RANKL/OPG的调节,影响DDPSCs的破骨分化能力。

尼古丁作用下牙周膜细胞c-Fos通路表达变化的相关研究

目的探索尼古丁作用于人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligam ent fibroblasts,hPDLF)后c-Fos通路相关因子的表达变化,为揭示其参与吸烟相关性牙周炎的可能功能作用提供理论依据。方法改良组织块法培养hPDLF,时间和浓度梯度实验选择理想尼古丁作用时间及浓度,qPCR及蛋白印迹实验分别观察尼古丁和/或α-银环蛇毒素(α-Bungatoxin,α-BTX)作用于牙周膜细胞后c-Fos mRNA及蛋白表达。结果尼古丁作用于hPDLF后,c-FosmRNA和蛋白表达上调,变化具有浓度和时间依赖性。10-5 M尼古丁作用于牙周膜细胞1 h后,c-Fos mRNA及蛋白的表达上调最为显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。尼古丁特异型受体烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(α7 acetylcholine receptor,α7 nAChR)特异性拮抗剂α-BTX可显著逆转这一作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论尼古丁可能通过α7 nAChR调节c-Fos表达及活性从而在吸烟相关性牙周炎中发挥破坏作用。

α-芋螺毒素AnIB[A11G]荧光标记的合成及应用

目的:合成α-芋螺毒素AnIB[A11G]荧光标记物,并用于测定烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α3β2在小鼠脑内的分布。方法:利用两步氧化法设计合成α3β2高选择性抑制剂AnIB突变体AnIB[A11G],纯化后,用5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(5-TAMRA-SE)标记,标记物鞘内注射到小鼠脑内,用激光扫描共聚焦显微镜测定α3β2在小鼠脑内的分布。结果与结论:获得了单一5-TAMRA-AnIB[A11G]荧光标记物,测定表明小鼠脑内nAChRα3β2主要分布于海马区域。

α-芋螺毒素Lt1.1的克隆、合成及靶点鉴定

目的发现作用于神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的拮抗剂,为研制新型镇痛药和神经生物学工具奠定基础。方法根据芋螺毒素A超家族DNA中保守的内含子及3'端非转录区(3'UTR)设计引物,从中国南海信号芋螺(Conus litteratus)中克隆获得新芋螺毒素Lt1.1序列。固相法合成Rink树脂肽,经裂解、空气氧化折叠、纯化后获得目的肽,利用两步氧化折叠法鉴定其二硫键连接方式。将神经元nAChR各亚基的cRNA在爪蟾卵母细胞中表达,利用双电极电压钳检测通道电流。结果获得一种新α-芋螺毒素Lt1.1序列(GCCSHPACNVNNPDICNH2),其二硫键连接方式为"C1-C3、C2-C4",作用靶点为nAChR α3β2和α3β4亚型,IC50分别为166.76和190.00nmol/L。结论 Lt1.1是一种典型的4/7型α-芋螺毒素,其选择性抑制了nAChR α3β2和α3β4亚型。