烟草NtFtsZ2-1基因参与叶绿体分裂和扩大的调节(英文)

叶绿体虽然是植物细胞内一种极其重要的细胞器,但其分裂的分子机制尚不很清楚。已经证明FtsZ 蛋白作为真核细胞分裂装置的一个关键成分,参与叶绿体的分裂过程。烟草的 FtsZ 基因属于 2 个不同的家族,在对 NtFtsZ1 家族成员研究的基础上,用正义和反义表达技术研究了 NtFtsZ2 家族成员NtFtsZ2-1 基因在转基因烟草中的功能。显微分析结果表明NtFtsZ2-1基因的表达水平异常增强或减弱都会严重干扰叶绿体的正常分裂过程,导致叶绿体在形态和数目上的异常(体积明显增大,数目显著减少),而单个叶肉细胞中叶绿体的总表面积在正反义转基因烟草和野生型烟草之间保持了相对稳定,没有发生明显的变化。同时还证明NtFtsZ2-1基因表达的变化对叶绿素含量和叶绿体的光合作用能力没有直接的影响。据此我们认为NtFtsZ2-1基因参与叶绿体的分裂和体积的扩大,其表达水平的波动会改变植物中叶绿体的数目和大小,而且在叶绿体的数目与体积之间可能存在一种补偿机制,保证叶绿体能最大限度地吸收光能,从而使光合作用得以正常进行。

烟草叶绿体分裂基因NtFtsZ2-1的克隆与功能分析

FtsZ蛋白在叶绿体的分裂过程中担负着重要作用,高等植物中FtsZ蛋白的陆续发现和功能分析加深了人们对叶绿体分裂机制的认识。植物中的ftsZ基因可分为两个明显不同的家族,在对烟草ftsZ1家族的研究基础上,对烟草ftsZ2家族成员的NtFtsZ2-1基因做了进一步的功能分析。研究结果表明,NtFtsZ2-1在叶绿体的分裂过程中发挥着重要作用,该基因的过量与减弱表达均对叶绿体的形态和数目产生了明显的影响。

叶绿体分裂相关基因NtFtsZ2-1在大肠杆菌中的表达与定位

FtsZ蛋白在细菌的分裂中担任着重要作用,能够在分裂位点形成一个环状结构而控制细菌的分裂过程。胞内FtsZ蛋白浓度的明显降低或异常升高均可阻断正常的细胞分裂过程进而导致丝状菌体的产生。我们为了研究烟草FtsZ蛋白与大肠杆菌FtsZ蛋白的异同,构建了烟草全长ftsZ2-1与绿色荧光蛋白EGFP的融合表达质粒并转化大肠杆菌JM109。融合表达质粒的过量表达导致宿主菌形成了丝状菌体。通过荧光显微镜观察发现NtFtsZ2-1-EGFP融合蛋白沿着宿主菌体的纵轴方向有规律地聚集成荧光点或荧光带,说明烟草FtsZ2-1蛋白能够识别宿主菌内分裂位点的定位信号并参与其细胞分裂复合物的组装。

LC/MS法定性定量测定烟草中的1-氨基-1-脱氧-2-酮糖

在合成1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖(Fru-Pro)和1-脱氧-1-L-丙氨酸-D-果糖(Fru-A la)的基础上,以Fru-Pro和Fru-A la作标样,建立了高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC/MS)定性定量分析烟草中这2种物质的方法,并采用该方法测定了16个烟草样品。结果表明:①通过保留时间和SCAN模式下的质谱碎片能准确定性这2种物质,通过SIM模式选择正离子(m/z)278.0和252.0可分别定量Fru-Pro和Fru-A la;②Fru-Pro和Fru-A la的检出限分别为25.0和30.0μg/g,回收率93.1%和105.8%,RSD 4.23%和3.97%;③3个烤烟烟叶样品中的Fru-Pro和Fru-A la含量远远高于3个白肋烟叶样品,5个国产烤烟型卷烟样品中这2种物质的含量比1个进口烤烟型卷烟、2个国产和2个进口混合型卷烟样品都高。该方法适合烟草中这2种1-氨基-1-脱氧-2-酮糖的同时定性定量分析。

4-(2-羟基-4-硝基苯偶氮)-1-苯基-3-甲基吡唑啉酮光度法测定烟草中钙的研究

在弱碱性介质中 ,4- ( 2 -羟基 - 4-硝基苯偶氮 ) - 1 -苯基 - 3-甲基吡唑啉酮与钙生成红色络合物 ,λmax=51 0 nm,ε=2 .89× 1 0 4 L·mol-1·cm-1,钙含量在 0～ 2 0 μg/2 5ml内符合比耳定律 ,方法用于烟草样品中钙的测定 。

4-(2-羟基-4-硝基苯偶氮)-1-苯基-3-甲基吡唑啉酮光度法测定烟草中镁

研究了 4 - (2 -羟基 - 4-硝基苯偶氮 ) - 1-苯基 - 3-甲基吡唑啉酮 (HNAPMP)与镁的显色反应 ,在 p H=10的硼砂 -氢氧化钠缓冲介质中 ,HNAPMP与镁反应生成 2∶ 1稳定络合物 ,λmax=5 2 2 nm,ε=3.5 8× 10 4L·mol-1· cm-1。镁含量在 0— 2 0 μg/2 5 m L范围内符合比耳定律 ,方法用于烟草样品中镁含量的测定 。

烟草抗赤星病突变体ces2-1的产生和鉴定

用烟草花叶病毒弱毒株系N14预先接种,可以诱导烟草对病原真菌赤星病菌的系统获得性抗性(SAR),减轻病菌引起的赤星病。选择表现诱导抗性最强植株材料进行组织培养与植株再生,通过体细胞无性系变异增强和巩固SAR性状,获得SAR组成性表达的突变体(constitutive expresser of SAR)ces2-1。除了抗病表型,ces2-1还组成性表达多种防卫反应基因。回交实验与遗传分析表明,ces2-1是在野生型位点上的单基因显性突变。对ces2-1与野生型进行mRNA差异显示分析,得到一个ces2-1独有、在野生型中缺少的转录本,与前人报道的烟草受过氧化氢诱导的一个基因片段同源。用cDNA末端快速扩增技术克隆了这个转录本的全长序列,根据生物信息学分析与功能的初步测定,把这个基因命名为烟草受过氧化氢诱导的抗病相关基因(hydrogen peroxide-induced1,NtHPI1)。

水杨酸和2,1,3-苯并噻二唑诱导烟草抗赤星病的效应研究

【目的】为探索外源物质水杨酸(salicylic acid,SA)和2,1,3-苯并噻二唑(2,1,3-Benzothiadiazole,BTH)诱导烟草抗赤星病的效应。【方法】选用红花大金元烟草幼苗为试验材料,分别用0.25~2.0 mmol/L SA和0.1~2.0 mmol/L BTH喷施烟草幼苗,48 h后接种赤星病菌(Alternaria alternate),测定病斑直径以筛选SA和BTH诱导烟草抗赤星病的最适浓度。基于此,用上述最佳诱导浓度SA和BTH预处理烟草叶片后接种赤星病菌,测定烟草幼苗叶片过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)等防御酶的活性以及丙二醛(MDA)含量。【结果】0.5~2.0mmol/LSA预处理烟草幼苗,其病斑直径均明显低于对照组,其中2.0 mmol/L SA处理的诱导效果最佳为23.01%;0.1~0.5 mmol/L BTH可有效降低烟草病斑直径,以0.2 mmol/L BTH的诱导效果最佳,为22.43%;最佳诱导浓度SA和BTH处理组的CAT、POD和PPO防御酶活性在接种后15d内显著高于对照组,而MDA含量则低于对照组,表明外源SA和BTH对赤星病的诱导抗性作用,可能与其提高烟草防御酶活性并降低MDA含量有关。【意义】上述研究将为烟草赤星病防控提供理论参考。

介质碰撞萃取结合气相色谱法测定烟草及烟草制品中水分、1,2-丙二醇、丙三醇和烟碱的含量

测定传统卷烟中水分、1,2-丙二醇、丙三醇和烟碱的行业标准已经不适用于新型卷烟产品。为开发适用于全品类烟草及烟草制品中水分、1,2-丙二醇、丙三醇和烟碱的测定方法,提出了以含6.5 g·L^(-1)异丙醇(水分的内标)、2.5 g·L^(-1)1,4-丁二醇(1,2-丙二醇和丙三醇的内标)和4.0 g·L^(-1)正十七烷(烟碱的内标)的体积比为100∶15的甲醇-三乙胺混合液为萃取剂的介质碰撞萃取结合气相色谱的分析方法。取烟草样品0.4000 g,不需要破碎处理,置于15 mL离心管中,加入10 mL萃取剂,在线速率为4 m·s-1的条件下室温处理2 min,静置3 min,取上清液过0.22μm有机系滤膜后进行气相色谱分析。结果表明:介质碰撞萃取前处理方法只需要2 min即可实现对烟草及烟草制品中4种主要成分的完全提取。水分标准曲线的线性范围在10.00 g·L^(-1)以内,1,2-丙二醇、丙三醇、烟碱标准曲线的线性范围在5.00 g·L^(-1)以内,检出限(3s)为0.030~0.35 mg·g^(-1)。对同一样品进行日内精密度(n=6)和日间精密度(n=8)试验,测定值的相对标准偏差小于4.0%。按照标准加入法进行回收试验,回收率为95.2%~100%。

N-丁基-2-甲基-3-乙酰基-5-(1',2',3',4'-四羟基丁基)吡咯的热裂解气相色谱-质谱分析

以D-(+)-氨基葡萄糖盐酸盐为原料,通过环化和烷基化反应合成了目标化合物N-丁基-2-甲基-3-乙酰基-5-(1',2',3',4'-四羟基丁基)吡咯,并通过~1HNMR、^(13)CNMR、IR和HRMS技术对其结构进行表征。采用热重-微分热重-差示扫描量热法(TG-DTG-DSC)分析了目标化合物的热变化情况,结合热裂解-气相色谱-质谱技术(Py-GC-MS)研究了目标化合物在300、600、900℃的热裂解行为,并对目标化合物进行卷烟加香评吸。结果表明:目标化合物的初始裂解温度为137.6℃,二次裂解温度为224.9℃,900℃时裂解物失重约65%;裂解产物总共有43种,其中有2,3-二甲基吡咯、N-甲基-3-乙酰基吡咯、2,4-二甲基-3-乙酰基吡咯等多种具有香味特征的物质;随着温度的升高,总裂解产物的量有增加趋势;目标化合物能够有效改善卷烟品质,增加卷烟香气,并以添加相对烟丝质量的0.03%时,其加香效果最为适宜。初步探讨了目标化合物可能的裂解机理,为研究其在卷烟燃烧过程中的转化行为提供参考。

phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得

利用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从类产碱假单胞菌YS1(PseudomonaspsuedoalcaligeneseYS1)染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因 :phaC1、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对 phaC1基因进行了改造 ,经过基因拼接构建了植物表达载体pC3C1(嵌合phaC1)、pC3C2 (嵌合 phaC2 )和 pC3C1C2 (嵌合 phaC1和 phaC2双基因 )。将构建好的嵌合 phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体 pC3C1C2 ,用冻融法转入根癌土壤杆菌 (AgrobacteriumtumefaciensEHA10 5 )并且通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草 (NicotianatobacumHonghuadajinyuan)。 2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株 ,抗性植株大田生长表型正常 ,生长速度相对缓慢。抗性植株经过PCR、PCR Southern、Southern检测初步确定有 32 %烟草稳定整合了 phaC1和 phaC2。用氯仿 -次氯酸钠直接从部分Southern检测阳性转化植株中抽提纯化得到PHA ,在产物合成水平确证有 2 5 6

固相萃取-高效液相色谱法测定烟草中的两种多羟基吡嗪异构体

用固相萃取-高效液相色谱-二极管阵列检测法建立了测定烟草中两种多羟基吡嗪异构体的方法。烟草中的2-（1′,2′,3′,4′-四羟基丁基）-5-（2″,3″,4″-三羟基丁基）-吡嗪（2,5-DOF）和2-（1′,2′,3′,4′-四羟基丁基）-6-（2″,3″,4″-三羟基丁基）-吡嗪（2,6-DOF）用甲醇索氏萃取2h后,提取液用Waters Sep-Park-C18固相萃取小柱预分离,选择Waters carbohydrate analysis（3.9 mm×300 mm）色谱柱（NH2柱）,V（乙腈）∶V（水）=80∶20为流动相,流速：1.0 mL/min,烟草中的2,5-DOF及2,6-DOF达到基线分离。两种异构体的标准曲线的线性回归系数均大于0.9996,线性范围为0.5-100μg/mL;标准回收率分别为98%和104%;相对标准偏差均小于3%;检出限为0.2μg/mL。用该方法测定了不同卷烟中的2,6-DOF和2,5-DOF两种异构体。

诃子提取物清除自由基活性研究

考察了诃子提取物及其色谱纯化物(a、b、c)清除自由基的活性能力,进行了1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH.)清除试验。结果表明,甲醇提取物、乙酸乙酯提取物及其色谱纯化物均具有清除自由基活性的能力,甲醇粗提物活性略高于等体积1 mg/mL TBHQ,而其色谱纯组分c的活性最高,约为1 mg/mL TBHQ的1.2倍,且略高于茶多酚;乙酸乙酯组分色谱纯组分a,b抑制率分别为其粗提取物的1.6和1.1倍。色谱纯成分经显色反应、UV和H1NMR检测后被确认为诃黎勒酸衍生物或诃子单宁水解碎片,此为诃子提取物作为烟用自由基清除剂提供了有效的理论依据。

新鲜烟叶中的1个新二萜类成分

目的研究烟草Nicotiana tabacum叶中的西松烷二萜类化学成分。方法采用柱色谱技术对烟草的95%乙醇提取物进行分离纯化,采用波谱技术结合化学方法进行结构鉴定。结果从烟草提取物中分离得到了5个西松烷二萜类成分,分别鉴定为(1R,3E,7E,10S,11E)-3,7,11-cem-bratriene-10,15-diols(1)、(1S,2E,4S,6R,7E,10E,12S)-2,7,10-cembratriene-4,6,11-triol(2)、(1S,2E,4R,6R,7E,10E,12S)-2,7,10-cembratriene-4,6,11-triol(3)、(1S,2E,4S,6R,7E)-4,6,11-trihydroxy-1-isopropyl-4,8-dimethylpentadeca-2,7-dien-12-one(4)、(1S,2E,4R,6R,7E,11S,12S)-11,12-epoxy-2,7-cembradiene-4,6-diol(5)。结论化合物1为1个新化合物,命名为烟叶二萜B;化合物4首次在植物中发现,为1个新的天然产物。