茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响

目的:研究茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响。方法:制备烟草悬凝物(cigarette smoke condensate,CSC),采用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethyl thiazoly)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT]法测定人支气管上皮细胞株(HBE135-E6E7)的生长情况;荧光-化学发光仪测定细胞内氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平;DNA ladder法检测HBE135-E6E7凋亡;反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)法检测Bcl-2和BaxmRNA表达。结果:CSC组与CSC+茶多酚组细胞内ROS水平均明显高于对照组(P<0.01),CSC+茶多酚组细胞内ROS水平则明显低于CSC组。CSC组出现明显的DNA断裂拖尾带,CSC+茶多酚组仅出现少量的断裂拖尾带。RT-PCR结果显示:与对照组相比,CSC组Bcl-2mRNA表达降低(P<0.01),BaxmRNA表达升高(P<0.01);与CSC组相比,CSC+茶多酚组Bcl-2mRNA表达升高(P<0.01),BaxmRNA表达降低(P<0.01),CSC组与CSC+茶多酚组Bcl-2mRNA/BaxmRNA值明显低于对照组(P<0.01)。结论:茶多酚可拮抗CSC诱导人支气管上皮细胞凋亡,其机制可能是通过有效清除ROS,促进Bcl-2mRNA表达和抑制BaxmRNA表达实现的。

低剂量烟草悬凝物诱导正常永生化人支气管上皮细胞慢性恶性转化

目的：用低剂量烟草悬凝物模拟吸烟环境诱导正常永生化人支气管上皮细胞慢性恶性转化,构建恶性转化的细胞模型。方法：通过MTT法及细胞亚急性毒性存活能力检测实验确定慢性诱导物的剂量,以不同剂量的烟草悬凝物对细胞进行单次或多次染毒,以不染毒细胞为对照。用血清抗性实验和锚着独立生长实验鉴定细胞恶性转化的倾向和恶性特征,比较各组抗血清促分化的能力和集落形成率。结果：以体积分数为0.5、1、2μl/ml的烟草悬凝物对细胞进行单次和多次染毒,各相应剂量组多次染毒和单次染毒与对照组相比,传至第25代细胞,其抗血清促分化的能力均差异明显（P〈0.05）;传至第38代,成功建立细胞恶性转化模型,细胞复层生长,无接触性抑制,染色体异常,转化细胞的锚着独立生长实验克隆形成率均明显高于对照组（P〈0.05）。多次染毒组的恶性转化趋势比单次染毒组强,而且剂量反应关系呈现良好的直线相关（r=0.969,y=42x）。结论：用0.5~2μl/ml烟草悬凝物诱导的正常永生化人支气管上皮细胞恶性转化,可作为模拟吸烟环境下细胞慢性恶性转化的理想模型。

烟草悬凝物诱导永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中p16基因甲基化改变的研究

目的:探讨永生化人支气管上皮细胞(HPV-18 immortalized human bronchial epithelial cells,BEP-2D)恶性转化过程中p16基因甲基化改变。方法:选取正常BEP-2D细胞及经过烟草悬凝物处理后的15周(week-15,W-15)、25周(W-25)、38周(W-38)和43周(W-43)的BEP-2D细胞作为研究对象,采用巢式MSP(Nested-methylation-specific PCR,Nested-MSP)检测各细胞株中p16基因的甲基化改变情况。结果:正常BEP-2D细胞p16基因未发生甲基化,而烟草悬凝物处理后的15周、25周、38周和43周的BEP-2D细胞p16基因发生甲基化。结论:p16基因甲基化改变可能发生在肺癌形成的早期,检测p16基因甲基化可以作为肺癌早期辅助诊断的生物标记物之一。

烟草悬凝物对人支气管上皮细胞急性毒性损伤的研究

目的通过研究烟草悬凝物(CSC)对人支气管上皮细胞(BEP-2D cells)急性毒性损伤生物学作用,探讨烟草烟气在人支气管上皮细胞损伤过程中的机制,为呼吸道疾病的防治措施提供实验依据。方法收集某品牌香烟烟气并溶解于LHC-8培养液制备成CSC;采用永生化的人支气管上皮细胞,分为对照组(BEP-2D cells)和实验组(BEP-2DCSC cells)。观察烟草悬凝物染毒后的细胞存活率、膜通透性损伤、细胞凋亡率和次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(HPRT gene)突变率。结果在急性毒性损伤过程中,随着CSC浓度的逐渐增加:细胞存活率逐步下降、细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)逐渐且明显增多、细胞的早期和晚期凋亡率均增大、HPRT基因突变率逐渐增大,均与染毒剂量具有明显量-效关系。结论CSC作为一种复杂的香烟烟气混合物具有较为典型的急性细胞毒性作用,其机制可能与细胞膜通透性增加、细胞凋亡及HPRT基因突变有关。

烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞系恶性转化过程中染色体畸变

目的:研究染色体畸变与细胞恶性转化之间的关系,探讨烟草致肺癌的发生机制.方法:将细胞分为2组:对照组为正常人支气管上皮细胞;实验组为经烟草悬凝物(CSC)处理P15(Passage,P),P20,P25,P30,P35及P38细胞.采用细胞遗传学方法观察染毒后CSC诱导的人支气管上皮细胞染色体畸变情况.结果:对照组各代细胞二倍体占细胞总数94%～98%,异倍体及多倍体细胞总数为17个,发生率为3%,而且能够在传代过程中基本保持核型及染色体数目稳定.实验组细胞从P15开始逐渐失去正常2n=46核型,二倍体细胞从83%递减至53%,异倍体及多倍体细胞总数196个,发生率为32.7%,与对照组相比较,差异具有统计学意义(χ2=152.5552,P<0.01).对照组各代细胞结构畸变的发生细胞总数6个,发生率为1%;而实验组各代细胞结构畸变的发生细胞总数60个,发生率为10%,与对照组比较差异具有统计学意义(χ2=40.0834,P<0.01);并在P38出现了内复制现象和环状染色体,发生率分别为4%和1%.结论:CSC可影响BEP-2D细胞染色体稳定性,使其发生畸变并最终促使细胞向恶性化方向转化;并在P15就发生染色体畸变.推测染色体畸变可能是早期事件.

烟草悬凝物诱导永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中survivin基因及蛋白表达的研究

目的:探讨人支气管上皮细胞(BEP-2D)恶性转化过程中survivin基因及蛋白表达的变化。方法:选取正常BEP-2D细胞及经烟草悬凝物处理后的第15代(P-15)、25代(P-25)、38代(P-38)BEP-2D细胞共4组细胞株作为研究对象,采用半定量反转录PCR(Retro-translation PCR,RT-PCR)检测各组细胞株中survivin基因变化,免疫组织化检测各组中survivin蛋白的表达。结果:1.survivin mRNA在正常细胞BEP-2D中的表达强度为0.08,在转化的肺癌细胞P-15、P-25和P-38中分别为0.56、0.80和0.81。2.survivin蛋白在正常BEP-2D细胞株中表达阴性,在转化的3组细胞中表达阳性,且survivin蛋白在正常细胞与转化细胞株中的表达存在明显差异,其中在P-15具有明显差异(P<0.05)。结论:survivin基因及蛋白的表达水平可作为早期肺癌的一个检测指标。