云南番茄曲叶病是由烟草曲茎病毒引起的

从云南省德宏田间表现曲叶症状的番茄植株上分离到病毒分离物Y41,采集的带病植株在实验室可经烟粉虱(Bemisiatabaci)传播到健康的番茄。用针对非洲木薯花叶病毒(ACMV)、印度木薯花叶病毒(ICMV)及秋葵曲叶病毒(OLCV)的15种单抗对病样进行TAS-ELISA检测,结果表明,番茄曲叶病是由菜豆金色花叶病毒属(Be gomovirus)病毒引起的,但其抗原表位型与我国广西报道的中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCV)不同。对Y41进行DNA-A全序列测定和分析表明,Y41DNA-A全长2743个核苷酸,共编码6个ORF,其中病毒链编码AV1和AV2两个ORF,互补链编码AC1、AC2、AC3和AC44个ORF。对Y41及其它双生病毒CP进行同源性比较及系统进化关系分析表明,Y41属于"旧世界"的粉虱传双生病毒,与我国报道的烟草曲茎病毒(TCSV)及印度报道的番茄曲叶Karnataka病毒(ToLCKV)同源性最高,达到98 8%。进一步比较基因组发现,Y41与TCSVAV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4各ORF同源性分别为98 8%、96 6%、86 4%、93 3%、89 6%和89 7%,基因间隔区(IR)、DNA-A同源性分别为92 1%和93 4%,且在基因间隔区内含有相似的重复子序列及排列方式。这些结果表明:Y41是TCSV在自然条件下侵染番茄的一个分离物。

烟草曲茎病毒复制相关蛋白基因原核表达条件优化

为了提高烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)复制相关蛋白(replication-associated protein,Rep)基因在大肠杆菌中表达量,研究了大肠杆菌菌株、温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对GST-Rep融合蛋白表达量的影响.结果表明,大肠杆菌菌株Rosetta在37℃培养3h后,使用终浓度为0.5mmol·L-1的IPTG在28℃诱导培养4h时,GST-Rep融合蛋白表达量最高,表达的GST-Rep融合蛋白可占细菌总蛋白的42%以上.用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-Rep融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小约为66kD,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与GST多克隆抗体起特异性反应.Rep基因的优化表达为研究该基因的作用机理打下了基础.

烟草曲茎病毒 AC4基因的原核表达与免疫定位

利用 PCR方法从烟草曲茎病毒 ( Tb CSV) Y3 5分离物的病株中获得 AC4基因 ,将其克隆到原核表达载体 p ET-3 0 a上获得重组质粒 p ET-Y3 5 AC4,重组质粒导入大肠杆菌 BL2 1 ( DE3 ) p Lys S中 ,IPTG诱导后 SDS-PAGE发现 ,AC4蛋白已在大肠杆菌中获得了表达。利用 Ni2 +-NTA亲和树脂纯化了 AC4重组蛋白 ,免疫家兔获得 AC4蛋白的多克隆抗体。利用免疫胶体金技术对感病烟草中AC4蛋白进行定位发现,TbCSV AC4蛋白主要在细胞质的叶绿体和线粒体中积累。

侵染青蒿的烟草曲茎病毒的分子鉴定及基因组结构特征分析

菜豆金色花叶病毒属病毒是一类在全球热带及亚热带地区造成严重经济损失的植物病毒,田间杂草是这类病毒重要的中间寄主。本研究从云南省玉溪市采集了表现黄脉的青蒿植株,通过PCR扩增、克隆及测序从样品中获得两条菜豆金色花叶病毒属病毒DNA-A全基因组序列,分别为YN6393-23和YN6393-27,其全长均为2739 bp,相似性为100%。序列分析发现,YN6393-23和YN6393-27的核苷酸序列与烟草曲茎病毒Tobacco curly shoot virus(TbCSV)的分离物YN4584的核苷酸序列相似性最高,为99.45%。根据国际病毒分类委员会对菜豆金色花叶病毒属病毒种的分类标准,全基因组序列相似性大于91%则为同种病毒,表明此病毒分离物为烟草曲茎病毒的一个分离物。这是菜豆金色花叶病毒属病毒侵染青蒿植株的首次报道。

烟草曲茎病毒卫星DNA在不同寄主中的分子变异比较

The molecular variation of satellite DNA associated with Tobacco curly shoot virus (TbCSV) was compared by DNA sequencing of progenies of TbCSV DNA in Nicotiana benthamiana and N. glutinosa plants agroinoculated with infectious clones of TbCSV and its associated DNA. Comparisons indicated that TbCSV DNA populations had the higher levels of mutation frequency in N. glutinosa than that in N. benthamiana, and mutations generated in N. benthamiana were found upstream or downstream of C1 ORF whereas those in N. glutinosa were mostly located in A-rich region. No mutation was found in C1 ORF and satellite conserved region of DNA. The biological significance of the mutation accumulation and its role in disease epidemic were discussed.

烟草曲茎病毒Y128分离物及伴随卫星的分子鉴定

从云南保山田间表现曲叶症状的烟草植株上分离到病毒分离物Y128,病株在实验室可经烟粉虱(Bemisiatabaci)传播到健康烟草上。分别用针对烟草曲茎病毒(TbCSV)、云南烟草曲叶病毒(TLCYNV)、中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)及泰国番茄黄化曲叶病毒(TYLCTHV)等田间常复合侵染的云南粉虱传双生病毒的特异性引物对Y128DNA-A进行PCR扩增,结果表明Y128是烟草曲茎病毒(TbCSV)的1个分离物。利用DNAβ的特异性引物β01和β02,在Y128中扩增到卫星DNA分子(Y128β)。对Y128进行DNAβ全序列测定及分析表明,Y128β全长1350个核苷酸,其互补链上编码1个有功能的ORF(βC1)。Y128β的全序列与TbCSV各个分离物的卫星分子(Y2β、Y35β和Y115β)的同源性最高,分别为85·2%、94·3%和88%;与其它已报道的卫星DNAβ的同源性均低于56·1%。

烟草曲茎病毒复制蛋白基因的原核表达和免疫定位

利用PCR方法从烟草曲茎病毒 (TbCSV)Y35分离物的病株中获得复制蛋白 (Rep)基因 ,将其克隆到原核表达载体pGEX 4T 1上获得重组质粒pGEX Y35Rep。重组质粒导入大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中 ,IPTG诱导表达后发现部分Rep融合蛋白以可溶性形式表达。利用GST Sepharose 4B亲和层析柱纯化了Rep的融合蛋白 ,免疫家兔获得Rep蛋白的抗体。对TbCSV侵染烟草中Rep蛋白的亚细胞分布研究发现 ,Rep蛋白主要分布于含有细胞核的组份中。利用免疫胶体金技术对感病烟草中Rep蛋白进行了定位 。

与烟草曲茎病毒相伴随的DNAβ的βC1基因原核表达及蛋白的单抗制备

将PCR扩增的烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus，TbCSV）Y35分离物βC1基因克隆到pET-32a原核表达载体，构建原核表达重组载体pET32a-Y35βC1．重组载体导入大肠杆菌BL21（DE3），经过IPTG诱导、Ni^2＋ NTA亲和柱纯化获得与硫氧还蛋白融合的重组蛋白Y35βC1．以Y35βC1重组蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，用杂交瘤细胞技术制备了9株能够稳定传代并分泌抗Y35βC1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别制备它们的单抗腹水．9株单抗腹水的间接ELISA效价在10^-5～10^-6之间.Y35βC1单克隆抗体的研制为该蛋白的亚细胞定位及功能研究，明确Y35βC1基因在致病过程中的作用机理奠定了基础．

与含卫星DNA的烟草曲茎病毒伴随的nanovirus类DNA分子鉴定

利用已报道的两种粉虱传双生病毒DNA1分子的全长特异性引物进行PCR扩增 ,在含有卫星DNAβ的烟草曲茎病毒 (TbCSV)Y35和Y1 1 5分离物中扩增到一种单链环状DNA小分子(命名为DNA1 ) ,而在不含有卫星DNAβ的TbCSVY1和Y1 2 1分离物中没有扩增到DNA1分子 .免疫捕获PCR表明DNA1分子包裹在双生病毒粒子中 .Southernblot检测进一步证实仅在含卫星DNAβ的TbCSVY35和Y1 1 5分离物中存在DNA1分子 .序列分析表明 ,Y35和Y1 1 5DNA1序列全长分别为 1 36 7和 1 36 8nt ,各有一个较保守的开放阅读框 (ORF) ,编码类似nanovirus的Rep蛋白 .两个DNA1分子与辅助病毒DNA A序列无同源性 .Y35和Y1 1 5DNA1全长核苷酸序列同源性为 92 % ,ORF编码的氨基酸同源性为 96 % ,而与已报道的胜红蓟黄脉病毒和木尔坦棉花曲叶病毒的DNA1的核苷酸序列同源性为 70 %～ 79% ,氨基酸序列同源性为 87%～ 90 % .将DNA1与nanovirusesDNA比较后发现 。

烟草曲茎病毒／DNAβ病害复合体研究进展

烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)是从云南烟草上分离的双生病毒科Gemini-viridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus的一个新种,在番茄和烟草上可引起严重的曲叶病。该病毒与伴随卫星DNAβ形成的病害复合体在病毒致病性、DNAβ与辅助病毒的伴随关系及调控症状的作用等方面均与其它双生病毒病害复合体不同,对其进化起源的研究表明,TbCSV在进化中介于需要卫星的双生病毒和真正的单组分双生病毒之间,因而针对TbCSV病害复合体的研究对于解读双生病毒的起源和遗传进化机制具有重要意义。作者从TbCSV病害复合体的发生危害、基因组结构、伴随小分子DNA、各DNA组分互作以及起源进化等方面综述了该病毒病害复合体的研究进展。

B型烟粉虱携带传播烟草曲茎病毒的能力

B型烟粉虱近20年来入侵许多国家和地区,已成为重要的世界性作物害虫,其主要危害方式之一是传播双生病毒,造成作物病毒病大发生。应用PCR技术,研究了入侵我国的B型烟粉虱个体获取、存留及传播烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)的能力。B型烟粉虱在感染TbCSV的普通烟毒株上饲毒30min时,就可在40%的个体内检测到TbCSVDNA,个体带毒率随饲毒时间延长而增加,饲毒12h后,带毒率达100%;TbCSVDNA在B型烟粉虱体内可存留10天左右,但不能终身存留;传毒处理植株的发病症状及PCR检测结果表明,B型烟粉虱是TbCSV的传播媒介。

中国番茄黄化曲叶病毒和烟草曲茎病毒AC2和AC4蛋白为RNA沉默的抑制子

中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)能系统侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana) 等寄主植物,但不诱导明显的症状,而烟草曲茎病毒Y35分离物(TbCSV-Y35)单独侵染则诱导曲叶等症状.对表达GFP基因的转基因本氏烟接种实验表明,TYLCCNV-Y10不回复已建立的GFP沉默,也不抑制GFP沉默的建立;而TbCSV-Y35能部分回复已建立的沉默,且能在新叶抑制沉默的建立.农杆菌共浸润实验结果表明,TYLCCNV-Y10和TbCSV-Y35的AC2和AC4蛋白都能抑制GFP的局部沉默,并延迟GFP的系统沉默,为RNA沉默的抑制子.比较共浸润区GFP mRNA的积累结果表明,Y10 AC2与Y 35AC2蛋白具有相近的RNA沉默抑制能力,而Y35 AC4蛋白是一个比Y10 AC4蛋白更强的抑制子.因而,TbCSV-Y35和TYLCCNV-Y10致病性差异的原因可能与二者AC4蛋白的功能差异有关.

伴随卫星分子的两种单组分双生病毒TbCSV和TYLCCNV之间的拮抗互作

为明确烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leafcurl China virus,TYLCCNV)在不同寄主中的相互作用,将含有TbCSV分离物Y35(Y35)和TYLCCNV分离物Y10(Y10)及伴随卫星DNAβ(Y35β或Y10β)侵染性克隆的农杆菌按不同组合接种本氏烟和心叶烟,定期观察植株症状。结果表明,当Y10和Y35同时伴随Y10β或Y35β时,接种植株60天后,在本氏烟中引起的曲叶症状减轻,而在心叶烟中曲叶症状减轻的现象在侵染早期较明显,且植株表现的症状与Y35+Y10β或Y35+Y35β引起的症状相似。PCR及Southern印迹检测结果显示,在本氏烟植株中,两种病毒及卫星在整个侵染过程中均能复制,且Y10和Y35的复制水平在侵染后期均降低。在接种后15天的心叶烟植株中能检测到所有DNA组分,但接种100天后在这些植株中均不能检测到Y10的复制,而Y35的复制水平与单独伴随卫星相比差异不大。表明TbCSV与TYLCCNV在症状形成和复制水平上存在拮抗互作,且这种拮抗作用随寄主不同表现各异。

侵染木薯的两种单组分菜豆金色花叶病毒属病毒及卫星分子基因组结构特征分析

为明确木薯(Manihot esculenta Crantz)植株叶片皱缩、畸形是否由菜豆金色花叶病毒属病毒侵染引起,从云南省红河州田间采集具有疑似感染症状的木薯植株叶片样品,应用菜豆金色花叶病毒属病毒简并引物、种专化性引物及卫星分子引物进行PCR扩增、克隆,通过测序分析其核苷酸序列特征并对其进行系统进化分析。结果显示,从采集疑似病叶中共克隆获得4条菜豆金色花叶病毒属病毒DNA-A全序列和6条beta卫星分子全序列,经全序列分析发现侵染木薯的2种菜豆金色花叶病毒属病毒分离物分别属于烟草曲茎病毒(tobacco curly shoot virus, TbCSV)和中国胜红蓟黄脉病毒(ageratum yellow vein China virus, AYVCNV)。TbCSV木薯分离物全基因组核苷酸序列与分离自云南的TbCSV-YN2247(KX290925)分离物亲缘关系最近,相似性最高达到96.67%;AYVCNV木薯分离物全基因组核苷酸序列与分离自云南的AYVCNV-YN4326(KU601622)分离物亲缘关系最近,相似性最高达到95.80%;侵染木薯的beta卫星分子分别为赛葵黄脉病毒beta卫星(malvastrum yellow vein betasatellite, MaYVB)和中国胜红蓟黄脉病毒beta卫星(ageratum yellow vein China virus betasatellite, AYVCNB),MaYVB-YN6332-12全基因组核苷酸序列与分离自云南的MaYVB-Y216(KX290925)分离物亲缘关系最近,相似性最高达到96.4%;AYVCNB-YN6338-17全基因组核苷酸序列与分离自海南的AYVCNB-Hn9(KU601622)分离物亲缘关系最近,相似性最高达到90.4%,表明木薯是这两种菜豆金色花叶病毒属病毒的新寄主。单组分菜豆金色花叶病毒属病毒及其伴随beta卫星分子可以复合侵染木薯植株为首次发现。

2种单组份双生病毒与异源卫星DNA的互作

烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)Y35分离物(Y35)和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物(Y10)是从云南烟草上分离的2种单组份双生病毒,分别伴随卫星DNAβ(Y35β及Y10β)分子。将Y35和Y10分别伴随其同源或异源卫星(Y35β或Y10β)接种本氏烟和心叶烟,症状观察表明,无论Y10还是Y35伴随异源卫星DNAβ时引起的症状均与其伴随同源DNAβ引起的症状明显不同,且Y10β伴随Y35致病性最强。Southern印迹结果表明,Y10β及Y35β均可被异源辅助病毒稳定复制,但其复制水平明显低于伴随同源病毒时的水平,且植株中病毒和卫星的积累量并不完全与症状严重程度直接相关。