烟草花药特异表达基因启动子的克隆及序列分析

通过PCR扩增,从烟草(Nicotiana tabacum cv.NC89)中克隆了花药绒毡层中特异表达基因的启动子,序列分析表明,该启动子含1303个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99.4％。

拟南芥根特异表达基因启动子在烟草中的表达

以拟南芥为材料,利用PCR技术分离pyk10启动子序列,构建了该启动子GUS植物表达载体,农杆菌介导转化烟草,分析该基因在烟草中的表达,以明确拟南芥根特异表达基因pyk10启动子在烟草中的表达特性。结果表明:克隆的pyk10启动子与已报道的pyk10启动子一致性为100%,GUS基因在烟草的根部特异表达,表明该启动子为根部特异表达启动子,为揭示植物根的发生、分化和发育机制,以及培育抗根部病虫害和营养高效利用型转基因烟草奠定了基础。

银杏木质部特异定位表达基因启动子在转基因烟草中的功能研究

为了研究银杏GRP 1 8启动子在木本植物中的调控制特性 ,用从银杏细胞壁形成及纤维素生物合成密切相关的 ,并定位于形成层木质部维管组织细胞表达的富甘氨酸蛋白质基因 (GRP 1.8)的启动子与GUS报告基因构建的表达载体转化烟草 ,经过Southernblotting鉴定 ,得到一批转化再生植株 .经GUS组织化学检测 ,发现转基因烟草的茎木质部呈现GUS染色阳性 ,初步证明银杏GRP 1 8基因启动子确有韧皮部表达特性 。

碧冬茄花特异表达基因启动子PchsA的克隆与序列分析

根据 Ingrid M.报道的碧冬茄花特异表达基因 CHSA启动子的序列设计并合成一对特异引物 ,以碧冬茄总DNA为模板 ,通过 PCR扩增出约 370 bp大小的 DNA片段 ,回收后克隆到 p U Cm- T质粒载体上 ,经转化、筛选确定重组子 ,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序 ,得到片段长度为 370 bp.采用 DSgene分析软件进行序列分析发现其基本具有启动子的所有保守序列 ,TATA box,CCAAT box,Anther box,G- box,TACPy AT box,box1,box2 ,Capsite等 ,且经 Internet BL AST程序和 DSgene分析软件进行同源性对比和序列分析 ,显示序列与已报道序列同源性为 96 % .登陆 Gen Bank,ID号为 AY36 0 35 8.

番茄根特异表达基因LeGRP2启动子的克隆及其在拟南芥的表达分析

目的克隆获得番茄根特异表达启动子,为利用基因工程技术创制番茄新种质奠定基础。方法利用Clontech公司的基因组步移(genome walking)技术,扩增番茄根特异表达基因LeGRP2的上游调控序列,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性。结果以番茄基因组DNA为模板,经过2次基因组步移,获得了LeGRP2基因上游1959bp的调控序列(GenBank登录号:EU262719),分析发现含有9个与根特异表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1。转基因拟南芥的组织化学染色分析表明,GUS基因主要在拟南芥的根部特异表达。结论克隆获得了番茄LeGRP2基因启动子,该启动子主要在转基因拟南芥根部表达GUS基因,具有较强的根表达特异性。

梨韧皮部特异表达启动子AtSUC2驱动下的GUS基因的转化和表达

以‘Old Home’梨无菌苗叶片为外植体,利用根癌农杆菌介导将专一在韧皮部表达启动子AtSUC2驱动下的GUS基因转入‘Old Home’中。筛选出了‘Old Home’梨叶片高效遗传转化的最佳条件:农杆菌和外植体在液体培养基上共培比在固体培养基上共培转化率提高5倍。PCR分析和Southern杂交鉴定表明GUS基因已整合到转基因植株的基因组中,组织化学检测和Western杂交鉴定证明了GUS基因在转基因植株韧皮部中的表达。

烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对番茄的转化

利用PCR技术从烟草中克隆获得了893bp的根特异性表达基因TobRB7的启动子,命名为NT1。以pBI121为原始植物表达载体,用NT1启动子和番茄广谱抗病基因Pto分别取代CaMV 35S启动子和GUS基因,获得了烟草根特异启动子驱动抗病基因的表达载体,命名为pBI-NT1::Pto。采用冻融法将pBI-NT1::Pto导入根癌农杆菌EHA105中,以番茄子叶为外植体进行了侵染转化。PCR检测NPT Ⅱ基因的结果表明已获得转基因番茄植株。

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T中,测序表明,该基因为583bp,编码194个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。

玉米特异启动子驱动下结核hsp65基因植物表达载体构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-Hsp65联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中。结果表明:成功构建了pC1300GHsp65质粒,酶切鉴定得到3Kb和8.6Kb两条带,测序分析表明,克隆的Hsp65与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒条带大小与预期结果相符合。结果显示,已成功构建和转化了pC1300GHsp65质粒,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础。

水稻谷蛋白启动子驱动下的ipt基因在转基因烟草中的表达

利用农杆菌系统介导 ,采用叶盘转化法 ,将在水稻谷蛋白启动子驱动下的外源ipt基因导入烟草植株中 ,经过抗生素筛选、PCR与测序分析检测出转基因植株。成熟的转基因烟草种子经过ELISA细胞分裂素试剂盒检测 ,发现iPAs含量为对照的 2 .43倍 ,此外 ,种子的重量也增加了 7.8%。

卵巢特异启动子调控白介素24基因真核表达载体的构建

目的构建卵巢特异启动子-1(ovarian-specific promoter,OSP-1)调控白介素-24基因(Interleukin-24,IL-24)表达的真核表达载体。方法通过RT-PCR方法从人外周血基因组中扩增IL-24基因片段,应用基因重组技术将0SP-1启动子片段插入到pcDNA3.0真核表达载体,替换pcDNA3.0载体的CMV启动子与增强子序列,然后将克隆的IL-24基因片段插入到pcDNA3.0-OSP-1载体的OSP-1启动子的下游,从而构建成由OSP-1启动子调控IL-24基因表达的载体pcD-NA3.0-OSP-1-IL-24。结果载体构建过程的酶切结果以及测序结果表明载体pcDNA3.0-OSP-1-IL-24构建正确。结论通过基因重组技术成功构建了卵巢特异启动子调控IL-24基因表达的真核表达载体,为体外研究IL-24靶向特异性杀伤卵巢癌细胞提供了前期实验基础。

组织特异表达启动子RSS1P在转TiERF1基因小麦中的应用

从水稻叶片中克隆了一个韧皮部组织特异表达的水稻蔗糖合酶启动子(RSS1P),将RSS1P与中间偃麦草乙烯反应因子基因TiERF1相融合构成组织特异表达的TiERF1基因表达盒,取代pAHC20中Ubi::bar基因表达盒,构建成无选择标记的韧皮部组织特异表达的pA20-RSS1P::TiERF1载体。利用基因枪将pA20-RSS1P::TiERF1与pAHC20载体混合、共轰击小麦品种扬麦12的幼胚愈伤组织,获得转RSS1P::TiERF1基因小麦。对该转基因小麦T0和T1代植株进行PCR、PCR-Southern、半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析,证实外源RSS1P::TiERF1基因已转入受体,并且具有可遗传性;转入的RSS1P::TiERF1基因仅在根、茎、叶中表达,以根部表达量最高,在种子内不表达。纹枯病抗性鉴定和主要农艺性状考察结果表明,与受体扬麦12相比,转RSS1P::TiERF1基因小麦对纹枯病的抗性有明显提高,与转Ubi::TiERF1基因小麦的抗病性相当,而且转RSS1P::TiERF1基因小麦的农艺性状没有明显改变,说明可以利用RSS1P启动子创造更实用的转基因小麦新种质。

Rch10启动子引导iaaL基因在转基因烟草中的表达导致花器官发育的变异

来源于丁香假单孢杆菌 ( Pseudomonas syringae subsp.savastanoi)的吲哚乙酰胺赖氨酸酯合成酶基因 ( iaa L )与来自水稻 ( Oryza sativa)的在花器官中具有高水平表达的启动子 ( Rch1 0 )融合后导入烟草( N icotiana tabacum)。在转基因烟草中研究了这种嵌合基因的表达特性 ,并测定了各个器官内源生长素的水平。结果表明 :Rch1 0启动子能引导 iaa L基因在转基因植株的幼嫩花序、花器官及幼嫩果实中表达 ,并导致了各器官内源生长素水平不同程度的降低。转基因植株当代的花序或花器官的发育出现了明显的表型变异 :开花后顶端优势减弱、花序正常发育受阻、果实发育不良等。这些 Rch1 0 - iaa L的转基因植株可为进一步研究

烟草糖基转移酶基因启动子片段B的克隆与诱导表达

利用从烟草中克隆的一个新糖基转移酶(Glucosyitransferase,GTs)基因启动子中具有茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导的片段,与GUS(β-glucuronidase)报告基因连接,构建部分启动子片段缺失载体。利用农杆菌介导的叶盘转化法,获得了转基因植株,不同片段载体转基因植株的阳性率为50%～71%。对阳性转基因烟草植株GUS诱导活性的定量分析结果表明,在构建的4个表达载体中,启动子片段BA的基础表达水平非常低,并且不同转基因植株中都存在SA和MeJA双重诱导特征;片段BB和BC基础表达水平较高,不同转基因植株对SA和MeJA的反应不同;对于启动子片段BD,基础表达高于BA片段而低于BB和BC,不同转基因植株GUS活性均受SA诱导。推测在-756～-703之间(BA)存在MeJA和SA双重诱导元件,在-643～-606存在SA的诱导元件。对这些诱导元件的确定,有助于水杨酸和茉莉酸甲酯诱导机理的研究。

水稻花药特异表达基因RA8的启动子的分离和结构分析

根据文献设计一对引物 ,通过PCR的方法扩增了RA8是水稻花药特异表达基因的启动子。序列分析表明该启动子含有CAATbox的序列CAAT、TATAbox的序列TATAATA等表达调控元件 ,以及编码区的起始密码子ATG。

烟草雄蕊特异表达启动子TA29的克隆及序列分析

采用SDS法提取烟草(Nicotiana tabacum)叶片总DNA,根据GenBank中相关序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增获得一特异片段,并将其连接到pMD8-T载体上进行克隆测序。结果表明:该片段全长543 bp,与GenBank中报道的序列(AX012339)存在1个碱基的差异,同源性达99.8%;同时,采用生物软件对其进行序列分析,发现该片段含有启动子必备的核心元件:1个TATA-box、8个启动序列元件[PyPyAN(T/A)PyPy]以及1个CAAT-box、1个Cap site、1个I-box等元件,还存在与花粉特异性调控相关的AGAAA和GTGA等2个元件,推测该序列功能与雄蕊特异表达启动子TA29功能相同,从而为后期植物表达载体的构建及转基因奠定了基础。

棉纤维特异启动子E6基因表达载体的构建

以棉花cDNA为模板克隆了棉花纤维特异启动子E6,从质粒RDB1上切下植物的35S启动子,置换上棉纤维特异启动子E6。经PCR及酶切鉴定,得到了含E6基因的植物表达载体。

烟草绒毡层特异启动子TA29、解淀粉芽孢杆菌Barstar基因的克隆与测序

以基因组ＤＮＡ 为材料，分别对普通烟绒毡层特异启动子ＴＡ２９ 和解淀粉芽孢杆菌Ｂａｒｓｔａｒ 基因的编码序列进行了克隆和全序列分析。结果表明，ＴＡ２９ 全长１５２６ｂｐ ，含有ＴＡＴＡｂｏｘ；Ｂａｒｓｔａｒ 基因的编码序列全长２７３ｂｐ，包括起始密码子ＡＴＧ 和终止密码子ＴＧＡ。

玉米茎特异启动子克隆及其在转基因烟草中的活性分析

从玉米自交系‘综31’基因组中分离了1个茎特异表达启动子,命名为ZmSSP。用ZmSSP替换植物表达载体pCAMBIA3301的CaMV35S启动子,构建了ZmSSP驱动GUS报告基因的重组表达载体pCAMBIA3301-ZmSSP-GUS,并采用农杆菌介导法转化烟草,对转基因烟草营养器官中GUS表达模式进行了分析。结果表明:在烟草中ZmSSP活性低于CaMV35S启动子;不同转基因株系中ZmSSP活性及模式有显著差异;10个转基因株系统计结果表明,GUS表达量最高的营养器官是叶柄,平均是Actin基因表达量的2.71倍;其次是叶片和茎,在根中的GUS表达量最低,平均是Actin基因表达量的29.6%,是叶柄中活性的10.9%。研究认为,ZmSSP是较好的组织特异性启动子,适用于通过植物基因工程技术驱动目的基因进行地上营养器官的性状改良。