百香果响应烟草疫霉侵染的分子机制及基因挖掘

【目的】在转录水平上分析百香果响应烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)侵染的表达模式,挖掘抗性相关基因并解析其作用机制,为利用分子手段进行百香果抗病性状筛选和抗病品种选育打下基础。【方法】以百香果主栽品种钦果9号为试材,对烟草疫霉侵染12、24、48、72和96 hpi钦果9号进行组织表型观察和生理指标测定;采用转录组测序(RNA-Seq)构建钦果9号响应烟草疫霉侵染的转录组,使用DESeq分析基因表达差异,以P<0.005、错误发现率(FDR)≤0.001和|log2 Ratio|≥1为标准筛选差异表达基因(DEGs);通过BLAST2GO和KOBAS2等进行DEGs的GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析,明确钦果9号响应烟草疫霉侵染的主要通路和代谢途径;挖掘与植物抗病相关代谢通路的DEGs并利用MeV软件绘制基因表达热图,分析其在烟草疫霉侵染钦果9号过程中的动态变化趋势;实时荧光定量PCR验证基因表达量差异与转录组数据的一致性。【结果】烟草疫霉侵染钦果9号初期叶片无明显症状,侵染48hpi叶片出现褪绿,随着侵染时间不断延长,病斑颜色变深并不断扩大呈明显棕色枯斑;从侵染12hpi开始所有处理组钦果9号叶片中时超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于对照组(P<0.05),在24 hpi时SOD活性达最高值,表明侵染初期烟草疫霉已开始从伤口侵入钦果9号叶片。转录组分析共筛选获得7163个DEGs,KEGG信号通路富集分析发现,DEGs主要在植物激素信号转导、植物—病原菌互作、苯丙烷类生物合成、MAPK信号途径及类黄酮生物合成等与植物抗病相关的通路显著富集,表明这些通路在转录水平上是百香果响应烟草疫霉侵染的主要代谢途径。植物—病原菌互作通路中的PR1、CERK1、RPM1、CDPK和CML等基因,茉莉酸(JA)/乙烯(ET)信号途径中的JAR1、JAZ2、ERF1、EBF1和ERS等基因,以及次生代谢相关的CAD6、4CL、POD、CHS和LDOX等基因均在感染烟草疫霉的钦果9号植株中大幅上调表达,推测这些基因参与了百香果对烟草疫霉的抗性反应过程。实时荧光定量PCR结果验证了RNA-Seq数据的可靠性。【结论】植物激素信号转导、植物—病原菌互作、苯丙烷类生物合成、MAPK信号途径及类黄酮生物合成是百香果响应烟草疫霉侵染的主要信号通路和代谢途径。不同代谢途径中的关键基因以复杂方式参与了百香果对烟草疫霉的抗性反应过程。

玫瑰黄链霉菌联合杀菌剂对烟草疫霉的防治效果

为提高玫瑰黄链霉菌Streptomyces roseoflavus LN33对烟草黑胫病致病菌烟草疫霉Phytophthora nicotianae的防治效果。采用菌丝生长速率法测定了3种杀菌剂和LN33对烟草疫霉菌丝生长的毒力,计算EC50值;采用平板计数法测定3种杀菌剂与LN33的生物相容性,同时采用Horsfall法确定复配方案。试验结果表明,甲霜灵和烯酰吗啉对烟草疫霉菌丝生长具有较好的抑制作用,EC50分别为0.26和0.92μg/mL;甲霜灵和烯酰吗啉与LN33具有较好的生物相容性,当3.41×10~7 cfu/mL LN33菌悬液与0.26μg/mL甲霜灵体积比为6:4时,IR值为1.032。复配剂对烟草疫霉菌丝生长抑制率达77.06%,室内盆栽防效达86.96%,显著高于单剂防效。研究表明,甲霜灵可与玫瑰黄链霉菌LN33联用防治烟草黑胫病并减少一半化学农药施用量。

中国不同地区烟草寄生疫霉 (Phytophthora parasitica var.nicotianae)菌株的随即多态性DNA扩增分析(英文)

来自中国云南、辽宁、山东 3省的烟草寄生疫霉 (Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)菌株的致病性已被划分为 3种致病类型组 ,即强致病性组、中致病性组和弱致病性组。上述省是中国的烟草主产区 ,选自云南省的 15个烟草寄生疫霉菌株、山东省的 13个烟草寄生疫霉菌株和辽宁省的 2 0个烟草寄生疫霉菌株 ,选择 3个烟草栽培品种在温室内进行接种试验测定不同菌株的致病性分化。提取受试菌株的DNA ,利用PCR技术对受试菌株的模板DNA进行随机多态性扩增分析 ,对扩增DNA片段谱带借助于UPGMA分析法构建遗传树 ,结果表明 ,受试菌株被划分为4个遗传聚类组 ,每个遗传聚类组内包括不同的烟草寄生疫霉致病性菌株 ,而且来自于不同烟区相同的致病性菌株和每种致病性的不同菌株皆不属于同一个遗传聚类组内。结果表明RAPD -PCR的遗传标记分析结果与不同致病性组的划分未有明显的区别。因此 ,随机多态性DNA图谱的相同与不同不能当作区分来自不同烟区的烟草寄生疫霉的致病性分化的分子检测的工具。

3种拮抗烟草疫霉及产IAA内生细菌的分离鉴定

为挖掘河南省洛阳地区烟株体内的内生细菌功能菌株,以期开发优良生防菌剂。采用稀释涂布平板法分离纯化烟株各生育时期内生细菌菌株,采用平板对峙法、生长速率法测定内生菌株对烟草疫霉的抑制作用,紫外分光光度计法测定菌株产生IAA的水平。对筛选出的功能内生菌株进行形态学、生理生化鉴定及16S rDNA、gyrB序列分析鉴定,并测定对种子萌发的促生作用。结果表明,筛选出的12株内生菌株的鉴定结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7株,沙福芽孢杆菌(B.safensis)4株,奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)1株。芽孢杆菌属占菌株总数的91.67%,其中菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141具有较强的抑制活性,对烟草疫霉的抑菌率分别为88.10%、84.55%和73.33%;沙福芽孢杆菌菌株LYYY61-2、LYYY117对烟草疫霉的抑菌率达62.10%、64.72%;奇异变形杆菌菌株LYRY45产IAA水平达11.06 mg/L,具有较高的产IAA水平。12株细菌对烟草7种病原真菌具有不同程度的抑制作用,抑菌谱广,对烟草种子根长和总长均有显著的促生效果,其中菌株LYRY45的促生效果最为显著,种子萌发率达98.00%,处理组根长增长37.76%,茎长增长21.43%,总长增长33.96%。研究分离鉴定了洛阳地区健康烟株中3类具有抑菌、促生效能的内生细菌菌株,希望为生防菌防治烟草病害提供理论基础。

烟草疫霉对烟草的致病性及生理分化研究

将分离自东北、华东等11种寄主植物上的20个烟草疫霉(Phylophthora nicotianae,等于寄生疫霉Phytophthora parasitica)菌株接种6个烟草品种。测定了烟草疫霉对烟草的致病性及其生理分化.指出来自烟草的烟草疫霉菌株对烟草具较强的侵染能力,亦可以侵染黄瓜、茄子和番茄的果实,但大多数非烟草寄主来源的菌株经伤口接种亦可以侵染烟草,引起典型的症状.本研究还比较了不同的接种方法对测定烟草疫霉致病性及烟草品种抗病性结果的影响。

烟草疫霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及发酵条件优化

为了筛选对烟草疫霉菌具有拮抗作用的生防细菌菌株,本研究从烟草黑胫病病圃地采集健康烟株的根际土样,采用对峙培养法筛选得到8株对烟草黑胫病具有拮抗作用的细菌菌株,其中编号为LB-9的菌株对烟草疫霉菌的抑制作用最强且效果稳定,抑菌率为60.6%,且抑菌谱广,对其进行16S rRNA基因序列分析后将该菌株鉴定为多粘芽孢杆菌。采用单因素优化试验初步探究了多粘芽孢杆菌LB-9的最适发酵条件,明确了LB-9的最适发酵培养基、最适发酵温度、最适发酵时间和最适发酵初始pH值,对其生防制剂的开发应用具有重要意义。

哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究

哈茨木霉是一类重要的植病生防因子。哈茨木霉TH-1分别在PDA培养基、麦芽糖培养基、查氏培养基和琼脂培养基上培养均能产孢，其中PDA培养基为最适培养基。PDA培养基上，菌丝生长适宜温度27．5℃～35℃，最适温度32．5℃，产孢最适温度27．5℃。菌丝生长适宜pH值为3～7，产孢适宜pH值为5-9，生长与产孢最适pH值为5。光照对菌丝生长影响不大但明显影响菌株的产孢数量，光照时间越长产孢量越大。对峙培养试验表明TH-1明显抑制疫霉菌的生长速率，其无菌滤液明显抑制烟草疫霉菌游动孢子的萌发，并抑制游动孢子芽管的伸长，TH-1对游动孢子萌发的相对抑制率为12．7％，对芽管生长长度的相对抑制率为63．1％。水解酶平板活性测定显示，TH-1产生β-1，3葡聚糖酶与纤维素酶，从而使烟草疫霉菌细胞壁的消解，产生非挥发性抗生素抑制烟草疫霉菌孢子萌发，但对菌丝生长影响不大。

烟草疫霉的快速分子检测

根据烟草疫霉与其他疫霉菌ITS序列的差异设计了1对寡聚核苷酸引物,用于烟草疫霉的PCR检测。结果表明,在优化的反应体系与扩增条件下,该对引物表现出强特异性,只在烟草疫霉为模板的扩增体系中具有1条660 bp的条带。利用此特异性引物可稳定地从含有烟草疫霉的土壤及其发病组织中检测出病原菌。本实验提供并完善了一套快速检测烟草疫霉的方法和技术,特别对土传病害的准确诊断与快速检测在实践和理论上具有重要意义。

海南菠萝心腐病菌烟草疫霉的生物学特性研究

为明确海南菠萝心腐病菌烟草疫霉的生物学特性,研究不同培养基、温度、pH值和光照对病菌菌体生长和孢子囊产生的影响.结果表明,V8汁、胡萝卜两种培养基适宜菌丝生长,而V8汁、玉米粉和番茄3种培养基适合病菌产生孢子囊,尤其是番茄琼脂培养基,可诱导病菌产生大量孢子囊.病菌在10～35℃范围内均可生长,最适温度范围是24～32℃.最适pH值为5～8,在pH值7～8稍偏碱时,菌丝生长速度最快.光照条件对菌丝生长影响不明显,但明显促进孢子囊的产生.

烟草疫霉侵染前后剑麻叶片转录组学研究

为克隆剑麻受斑马纹病病原菌烟草疫霉侵染后的应答基因，以病原菌侵染前后的剑麻H．11648叶片为材料，构建剑麻转录组Unigene数据库；组装得到非冗余Unigene131422个，其中，500～1000bp的Unigen。占总数65．39％，Unigene的数量随其长度递减。GO分类分析发现：在得到的所有Unigene中，注释到生物过程的基因最多（152835）；细胞组分其次（129197）；参与分子功能的最少（47420）。KEGG代谢通路分析将剑麻转录组unigene分成128类，其中，参与生化代谢通路的Unigene最多，有9354个，占总数27．09％；参与植物一病原互作代谢通路的基因有1795个，占总数5．2％。基因表达丰度RPKM值显示上调基因9415个．下调基因28980个．其中参与病原互作的基因占680个．

土壤中烟草疫霉的分离与量化测定

从温室盆栽接种试验土和烟田土中分别取样，在室温下晾干，研碎并通过１ｍｍ直径的网筛，用选择性培养基土壤稀释平板法和叶片诱饵法分离烟草疫霉菌株；用土壤稀释平板法测定了云南主要烟区土样的烟草疫霉密度。结果看出，连作烟田的病菌密度高于轮作田，低凹烟田高于山地烟田。叶片诱饵法试验表明，以烟茎切片的诱集效果最好，其次是烟叶和马铃薯叶，番茄叶和辣椒叶的诱发效果相似，花生叶诱集不到烟草疫霉。

云南省大理州烟草疫霉交配型及甲霜灵敏感性研究

为明确大理州烟草疫霉的群体结构和抗药性水平,采用对峙培养法和含药平板法研究了2013—2014年大理州烟区烟草疫霉的交配型和对甲霜灵敏感性。结果表明,测定的大理州烟区的150个烟草疫霉菌株全部为A2交配型,未发现A1或A0交配型;263个烟草疫霉菌株对甲霜灵的EC50值分布于1.0829~33.6227 mg/L,平均EC50为8.7599±0.0358 mg/L。大理州烟草疫霉菌株对甲霜灵的敏感性差异显著,敏感、中抗和抗性菌株在群体中的比例分别为14.83%、52.85%和32.32%。大理州烟草疫霉在其侵染循环中主要进行无性繁殖,病原菌对甲霜灵的抗药性水平较高,中抗和抗性菌株分布广泛,亟需加快其他新型高效安全替代制剂的筛选和应用。

广西烟草内生细菌的动态分布及其对烟草疫霉的拮抗作用

从广西百色市的9个烟草品种中分离出470株内生细菌菌株,经常规细菌鉴定方法和16S rDNA序列分析,获得的菌株分别属于肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotro-phomnas)和假单胞菌属(Pseudomonas),其中土壤杆菌属和肠杆菌属为烟草内生细菌中的优势种群。烟草内生细菌的类群和数量随烟草种植地点、品种、器官和生育期的不同而不同。烟草内生细菌在根部数量最多,其次是茎和叶。内生细菌的总量从缓苗期到旺长期增加,之后显著下降。从470株烟草内生细菌菌株中筛选出对烟草疫霉有拮抗作用的菌株56株,其中芽孢杆菌菌株Y10的抑制效果最好,抑制率达91.48%,室内盆栽防治效果为68.72%。

大豆疫霉效应因子PsCRN115诱导烟草抗性的机制分析

CRN(crinkling and necrosis induced protein)蛋白是卵菌所特有的一类效应因子,在已经测序的疫霉种中,每个基因组中预测都含有上百个CRN基因,关于其功能和分子机制目前研究不多。前期研究发现,大豆疫霉效应因子PsCRN115是大豆疫霉的致病性必需因子且能抑制植物的细胞死亡。为了进一步研究PsCRN115的功能,本研究采用农杆菌渗入法介导的基因瞬时转化技术在烟草上过表达该基因,发现PsCRN115可显著提高烟草对烟草疫霉的抗性。随后采用荧光定量PCR研究了其作用机制,发现PsCRN115可诱导水杨酸(SA)通路防卫反应基因的高表达,但对乙烯(ET)和茉莉酸(JA)通路防卫反应基因的表达影响不显著。表明:大豆疫霉效应因子PsCRN115是致病必需的因子,能被植物所识别,并诱导植物的防卫反应。

芽孢杆菌1205和烟草疫霉处理后对烟苗防御酶的测定

分别将烟苗接种芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1205和烟草黑胫病菌病原菌烟草疫霉(Phytophthora parasitica Gzufp-9)在接种后1、3、5、7、9、11 d测定烟苗过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)3种与植物抗病密切相关的酶活性变化。结果表明,接种芽孢杆菌1 205后,PAL、PPO活性在5 d时达到最高值,明显高于对照和接种烟草疫霉,POD活性在接种1 d时即达到最高值。而接种烟草疫霉后PAL、PPO活性均在3 d时达到最高值,POD活性在接种1 d时达到最高值。

绿针假单胞菌PL9菌株对烟草疫霉的拮抗作用研究

利用离体拮抗试验和烟草幼苗生物测定法研究了棉花根圈细菌绿针假单胞菌 (Pseudomonascholoraphis)PL9菌株对烟草黑胫病病原菌烟草疫霉 (Phytophthoraparasiticavar .nicotianae)的拮抗作用 ,该菌株对烟草疫霉菌丝体有很强的抑制作用 ,并且可以完全抑制烟草疫霉游动孢子对烟草幼苗的侵染 ,其液体培养物浓缩过滤液也有相同的抑制作用 ,拮抗作用机理研究结果表明 ,其拮抗作用可能与PL9菌株分泌的抗生素类物质有关。为了解PL9菌株在烟草根圈的定殖情况 ,采用全套发光酶基因 (luxCDABE)标记的菌株PL9L进行跟踪 ,结果表明该菌株可以在烟草根圈成功定殖。

木霉菌对烟草疫霉的拮抗作用

通过对峙培养试验测定木霉菌(Trichodermaspp.)对烟草疫霉菌(Phytophthora parasiticavar.nicotianae)的抑制作用,筛选出对烟草疫霉菌具有拮抗作用的绿色木霉(T.viride)菌株TG050609.平板对峙培养试验结果表明:该木霉菌对烟草疫霉菌菌落生长的抑制率为29.12%,且能寄生于烟草疫霉;其挥发性次生代谢产物和发酵滤液对烟草疫霉也有明显的抑制作用.盆栽防治试验结果表明,该木霉菌对烟草黑胫病的防治效果达到56.53%,优于58%甲霜灵锰锌WP.

剑麻与烟草疫霉互作过程中的转录组研究

斑马纹病是剑麻的主要病害之一,为了挖掘剑麻斑马纹病抗病相关基因,以斑马纹病抗病品种热麻1号为材料,分别在接种0、24、36、48和72 h进行转录组测序,组装后获得103 326个转录本和70 110个Unigenes,转录本和Unigene的平均长度分别为726 bp和645 bp。其中有33 474个Unigenes被成功注释到NR,NT,KO,Swissport等7个功能数据库中。DEG分析表明,在接种24、36、48、72 h后分别有4 676、3 769、3 308、3 757个Unigenes被诱导差异表达,且PR蛋白,类黄酮生物合成、苯丙素类生物合成、过氧化物酶等基因上调表达明显,而热击蛋白、细胞色素P450和叶绿素a/b结合蛋白等基因明显下调表达。差异基因代谢通路分析表明,参与核糖体、光合作用、苯丙素类生物合成、苯丙氨酸代谢通路、植物激素信号转导途径、类黄酮生物合成途径、脂肪酸生物合成途径等代谢通路明显富集。本研究全面了解剑麻与烟草疫霉互作关系,是为剑麻斑马纹病抗病机制研究提供理论基础。

烟草疫霉拮抗菌筛选、鉴定及发酵条件研究

从毕节8个县市种植烟草的田地采集土壤样品122份,筛选出5株对烟草疫霉有较强拮抗作用的菌株。其中一菌株抑菌活性最强且拮抗效果稳定,综合形态学、生理生化及分子生物学实验可以将其鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),记为1205。该菌株现已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.M2012382。经过对1205菌株的液体摇瓶发酵条件研究,结果表明,1205菌株摇瓶振荡的最适培养条件:培养基为NYBD,接种量为1%,初始pH值为6.0,培养温度为28℃,装液量为20mL/100mL,摇床转速为160r/min,培养时间为28h。

一株Bacillus methylotrophilus的鉴定及对烟草疫霉防效研究

从石林水稻根际土壤筛选分离到一株细菌LL。经形态结构、生理生化测定及16S rRNA序列分析,鉴定为甲基营养性芽孢杆菌(Bacillus methylotrophilus)。室内拮抗烟草疫霉(Phytophthoraparasitica var.nicotianae)试验表明LL菌株对烟草疫霉菌有较好的抑制作用,抑菌圈直径达到1.1 cm,经烟草温室盆栽、田间小区试验,温室盆栽、田间小区防效试验,防治效果分别达到73.23%,66.98%。与58%甲霜灵-锰锌WP 500倍液防治效果相当(分别为69.67%和65.85%)。LL菌株的16S rRNA基因序列在Gen Bank的注册登录号为KF683169。