怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因克隆及其功能分析

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选得到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的核心片段,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因,并对其进行序列分析、亚细胞定位和器官表达分析。结果表明,怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA总长度为828 bp,G+C含量为46.50%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like由275个氨基酸组成,分子量为30728.97 u,等电点为5.39,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(28.36%)、β-片层(20.73%)、无规则卷曲(50.91%)构成;三级结构为单体跨膜蛋白;预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like主要存在液泡膜中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like与葡萄烟草病毒增殖蛋白2A(GenBank:XP_034708140.1、XP_002279170.2)的同源性最高,同源性达到86.79%。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白2A-like定位于细胞质和细胞核中。实时定量PCR结果显示,烟草病毒增殖蛋白2A-like基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like具有典型烟草病毒增殖蛋白2A的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度较高,进化上较为保守,且可降低植株的光合作用效率。

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因克隆和功能分析

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因,并采用生物信息学方法、转基因瞬时表达和实时定量PCR进行序列分析、亚细胞定位和器官表达分析。结果表明,怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A基因cDNA总长度为858 bp,G+C含量为49.53%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A由285个氨基酸组成,分子量31437.53 Da,等电点5.77,为亲水性蛋白;二级结构由α-螺旋(28.77%)、β-片层(16.14%)、无规则卷曲(55.09%)构成;三级结构为单体;预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A主要存在细胞核、线粒体、叶绿体和细胞质中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2 A在进化上与硬粒小麦、节节麦、乌拉尔图小麦、大麦、二穗短柄草的亲缘关系较近,尤其是与硬粒小麦未命名蛋白产物(VAH 15508.1)在进化上具有最高的亲缘关系。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白2 A定位于细胞质和细胞核中。实时定量PCR结果显示,烟草病毒增殖蛋白2 A基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高。

人骨形态发生蛋白_2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的 :研究人骨形态发生蛋白 2腺病毒表达载体 (Ad BMP 2 )转染人骨髓基质干细胞 (hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法 :利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP 2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果 :转染后 ,hBMP 2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP 2蛋白阳性表达 ,S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论 :Ad BMP 2可高效转染hBMSC ,且促进细胞增殖和成骨转化。

番茄花叶病毒移动蛋白和番茄抗病基因Tm-2^2的互作诱导烟草转化体程序性细胞死亡

番茄的抗病基因Tm -2 2 与番茄花叶病毒 (ToMV)的移动蛋白MP基因是一对互作的基因 ,Tm- 2 2 基因和ToMV MP基因同时在烟草中表达 ,并分别获得单一基因整合的纯合转化体植株。病毒接种试验表明 ,Tm -2 2 基因转化体与Tm- 2 2 番茄对Tobamavirus病毒的特异抗性结果一致 ;Tm -2 2 转基因植株和ToMV MP转基因植株杂交试验及其农杆菌注射试验均证明 :(1)Tm -2 2 基因与ToMV- MP在转基因烟草上保持“基因对基因”的互作关系 ;(2 )在外源乙烯的参与下 ,ToMV的移动蛋白与Tm -2 2 基因编码蛋白的互作能够诱导转化体程序性细胞死亡。这一结果为今后研究Tm -2 2 与MP互作的分子机制奠定了基础。

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因克隆、亚细胞定位和组织表达分析

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因的核心片段,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因,并采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR进行序列分析和器官表达分析。结果表明,怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因cDNA总长度为888 bp,G+C含量为51.58%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1由295个氨基酸组成,分子量33173.36 u,等电点9.16,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(43.73%)、β-片层(21.69%)、无规则卷曲(34.58%)构成;三级结构为单体;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1主要存在于内质网、内质网-质膜、细胞外、细胞质、线粒体和质膜中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1在进化上与Aegilops tauschii subsp.tauschill(节节麦)、Triticum turgidum subsp.durum(硬粒小麦)、Hordeum vulgare(大麦)的亲缘关系较近,尤其是与Aegilops tauschii subsp.tauschill(节节麦)烟草病毒增殖蛋白1在进化上具有最高的亲缘关系。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白1定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜中。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,烟草病毒增殖蛋白1基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号在叶中表达量最高,怀玉1号在茎中表达量最高。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1具有典型烟草病毒增殖蛋白1的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,对进一步揭示该酶生物学功能具有重要意义。

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因克隆和功能分析

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆该病毒增殖蛋白3基因,并进行序列分析、亚细胞定位、器官表达分析和功能分析。结果表明:怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因cDNA总长度为873 bp,G+C含量为44.22%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3由290个氨基酸组成,分子量33374.79 u,等电点9.72,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(57.24%)、β-片层(10.69%)、无规则卷曲(32.07%)构成;三级结构为单体;预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3主要存在质膜、液泡膜、内质网中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3与葡萄烟草病毒增殖蛋白3(GenBank:XP_002275179.1、GenBank:XP_034684444.1)的同源性最高,同源性达到94.83%。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白3定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜中。实时定量PCR结果显示,烟草病毒增殖蛋白3基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高;烟草病毒增殖蛋白3转基因阳性烟草的三叶青花叶病毒表达量显著高于烟草病毒增殖蛋白3转基因阴性烟草;与烟草病毒增殖蛋白3转基因阴性烟草相比较,烟草病毒增殖蛋白3转基因阳性烟草的净光合速率(P_(n))、气孔导度(G_(s))、蒸腾速率(T_(r))、最大光化学效率(F_(v)/F_(m))、实际光化学量子效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(q_(P))及电子传递效率(ETR)显著下降,而非光化学淬灭系数(NPQ)显著上升。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3具有典型烟草病毒增殖蛋白3的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,进化上高度保守,且可促进三叶青烟草花叶病毒的增殖,降低植株的光合作用效率。

丙型肝炎病毒核心蛋白对HePG_2细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察核心蛋白对细胞增殖和细胞周期调控的影响。方法 观察表达HCV核心蛋白的细胞株HePG2 C和作为对照的细胞株HePG2 CMV的细胞形态 ;绘制细胞生长曲线 ;检测细胞周期 ;用流式细胞仪、免疫组化染色检测PCNA ,P16 ,P2 7,P5 3;半定量RT PCR检测P16 ,P2 7,P5 3mRNA。结果 转染重组质粒PBK HVCC的HePG2 C细胞与转染空载体PBK CMV的HePG2 CMV细胞相比细胞形态未见明显变化。生长曲线显示HePG2 细胞在转染PBK HCVC和空载体PBK CMV后 ,生长速度无明显变化。检测转染空载体的细胞HePG2 CMV 81.3%进入G0 /G1期 ,7.7%进入S期 ;而转染PBK HCVC的细胞HePG2 C 73%进入G0 /G1期 ,13.7%进入S期。在进一步分子机制的探讨中发现HePG2 C细胞PCNA、P5 3表达显著增加 ,P16、P2 7表达显著降低。同样的变化也发生在转录水平。结论 HCV核心蛋白可能通过调节某些基因的转录与表达 ,增加细胞DNA合成 ,扰乱细胞周期 ,进而参与致癌过程。

H3N2流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达及其对293T细胞增殖的影响

目的:构建甲型H3N2流感病毒非结构蛋白-1(nonstructal-1,NS1)真核表达载体并表达其编码蛋白;探讨NS1对细胞增殖的影响。方法 :从江苏省甲型H3N2流感病毒毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/NS1质粒,双酶切pMD18-T/NS1与pXJ40-HA后,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法检测NS1转染细胞后对细胞增殖的影响。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NS1蛋白的表达。MTT法证实转染NS1质粒后对细胞增殖有抑制作用。结论:成功克隆了NS1全长基因,构建了其真核表达载体,并初步验证了NS1蛋白过表达后能抑制细胞的增殖,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1的细胞模型和NS1蛋白对细胞增殖和凋亡作用机制的进一步研究提供了基础。

腺病毒介导的小鼠胰岛细胞细胞周期蛋白A2基因过表达及其对细胞增殖的影响

目的探讨腺病毒介导的小鼠胰岛细胞细胞周期蛋白A2(cyclin A2)基因过表达及其对细胞增殖的影响。方法将对数生长期的小鼠胰岛素瘤MIN6细胞分为实验组、空病毒对照组及空白对照组,实验组及空病毒对照组分别给予腺病毒介导的cyclin A2基因及空腺病毒载体转染MIN6细胞,空白对照组不给予处理。检测3组MIN6细胞cyclin A2mRNA及蛋白的表达情况,以及细胞增殖活性。结果转染后24 h,实验组cyclin A2 mRNA及蛋白表达水平均高于空病毒对照组及空白对照组(P<0.05);转染后24 h、36 h、48 h、60 h及72 h,实验组的吸光度值均高于空病毒对照组及空白对照组(均P<0.05)。结论腺病毒介导的cyclin A2基因成功转染MIN6细胞,并可促进MIN6细胞增殖。

COX-2在乙肝病毒X蛋白(HBx)促进肝癌细胞和肝细胞增殖中的作用

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白(HBx)对肝癌的发生发展具有十分重要的作用.大量研究结果表明,与花生四烯酸代谢相关的磷脂酶COX-2与肿瘤细胞的增殖密切相关.为了阐明COX-2在HBx促进肝细胞增殖中的作用,在前期应用基因芯片方法检测发现稳定转染HBx基因的肝癌细胞H7402-X中COX-2基因表达明显上调的基础上,本研究应用免疫印迹技术在蛋白表达水平上获得了相同的结果.进而,应用COX-2的特异性抑制剂Indo分别作用H7402-X细胞和L-O2-X细胞(稳定转染HBx基因的人永生化L-O2肝细胞),观察HBx蛋白是否通过COX-2促进肝癌细胞或肝细胞增殖.BrdU掺入实验和流式细胞仪检测结果显示,50μmol/L的Indo可明显抑制H7402-X细胞和L-O2-X细胞的增殖.本研究结果提示,HBx可通过COX-2所介导的花生四烯酸代谢促进肝癌细胞和肝细胞增殖.

慢病毒介导的细胞分裂周期相关蛋白2基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨应用慢病毒介导小干扰核糖核酸(siRNA)沉默细胞分裂周期相关蛋白2(CDCA2)基因对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)与蛋白质印迹法(Western blotting)法分别检测人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A与乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549中CDCA2 mRNA及蛋白表达。构建慢病毒表达载体转染乳腺癌MCF-7细胞,实验分为对照组、Lv-NC组、Lv-siRNA-CDCA2组。采用噻唑蓝(MTT)实验及克隆形成实验检测沉默CDCA2表达对细胞增殖能力的影响;采用流式细胞仪检测沉默CDCA2表达对细胞凋亡能力的影响。Western blotting法检测细胞周期素D1(Cyclin D1)、CDK4、P21、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)蛋白表达。采用裸鼠移植瘤实验观察LvsiRNA-CDCA2对移植瘤体积及体质量的影响。结果乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549中CDCA2 mRNA[(2.18±0.13)、(1.56±0.09)、(1.83±0.10)比(1.02±0.06)]及蛋白表达水平[(1.13±0.15)、(0.56±0.08)、(0.79±0.11)比(0.23±0.04)]与MCF-10A相比显著升高(P<0.05),乳腺癌MCF-7细胞中CDCA2的表达水平升高最为显著;与Lv-NC组相比,Lv-siRNA-CDCA2组MCF-7细胞增殖活性与克隆形成率显著降低(P<0.05),而细胞凋亡率显著升高(P<0.05),可促进P21、Bax表达(P<0.05),而抑制Cyclin D1、CDK4、Bcl-2表达(P<0.05);与Lv-NC组比较,Lv-siRNA-CDCA2组移植瘤体积和体质量均显著降低(P<0.05)。结论慢病毒介导的CDCA2基因沉默可乳腺癌细胞细胞增殖,诱导细胞凋亡,并抑制肿瘤生长。

过表达连接子蛋白40(Cx40)通过引起细胞周期阻滞抑制H9c2大鼠心肌细胞增殖

目的 建立过表达连接子蛋白40(Cx40)的H9c2心肌细胞稳定株,初步探讨慢病毒载体介导的Cx40蛋白过表达对H9c2细胞增殖的影响及其相关机制。方法 采用实时定量PCR从H9c2细胞株扩增Cx40基因片段,与慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Puro连接,获得重组pLVX-Flag-Cx40表达载体。通过与包装质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,获得携带Flag-Cx40的重组慢病毒颗粒。感染的H9c2细胞经嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定表达株(H9c2-Flag-Cx40细胞)。采用Western blot法检测Cx40蛋白表达情况;通过CCK-8法检测Cx40对H9c2细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期的变化;实时定量PCR检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的mRNA表达;Western blot法检测cyclin D1蛋白表达;免疫共沉淀(Co-IP)实验检测H9c2细胞Cx40和Yes相关蛋白(YAP)的相互结合情况;分离胞质、胞核蛋白,利用Western blot法检测Cx40对YAP细胞定位的影响。结果 测序结果显示成功构建重组pLVX-Flag-Cx40表达载体,Flag-Cx40重组慢病毒可在H9c2细胞过表达,H9c2-Flag-Cx40稳定细胞株构建成功。与对照组相比,过表达Cx40明显降低H9c2细胞的增殖速率,细胞周期阻滞在G0/G1期,cyclin D1表达量降低。H9c2-Flag-Cx40稳定转染细胞的胞质中YAP表达量明显增多,而在胞核中的表达量明显减低,Cx40通过在胞质中与YAP结合,阻止其进入细胞核发挥转录共激活作用。结论 慢病毒介导Cx40基因过表达使H9c2细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期,并抑制其增殖。

猪圆环病毒2型Cap蛋白在烟草叶绿体中的表达

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的主要抗原。但Cap蛋白高昂的生产成本限制了它的广泛应用。为了探索Cap蛋白新的生产途径,本研究选择烟草叶绿体为表达平台,构建了ORF2抗原基因烟草叶绿体表达载体pNK-a03,并通过基因枪法(gene biolistics)将表达载体导入烟草叶绿体中。转化植株经PCR和RT-PCR检测,证实ORF2抗原基因已整合进烟草叶绿体基因组中且正常转录。蛋白质印迹检测和ELISA分析表明,Cap蛋白在烟草叶绿体内获得有效表达,具有免疫活性。此外,种子萌发研究结果显示,转基因烟草植株F1代具有aadA抗性,目的基因可正常进行遗传。这些研究结果为探索Cap蛋白的新型表达途径提供了理论基础。

基于烟草脆裂病毒构建同时表达2种外源蛋白的载体及其应用

目的构建在整个寄主植物中能同时表达两个非融合蛋白的病毒载体。方法以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料,缺失TRV RNA2的2b基因5’端279 bp并将其起始密码子ATG改变为AGG、同时引入豌豆早枯病毒(pea early-browning virus,PEBV)外壳蛋白(coat protein,cp)基因启动子,获得pTRV2e2载体;在pTRV2e2载体的2b和PEBV的cp启动子下游插入不同的外源基因,测定病毒TRVe2表达外源蛋白的能力、携带外源基因后重组病毒的稳定性以及分析蛋白质的生物学功能。结果病毒TRVe2能快速同时表达2个非融合的外源蛋白,且至少能表达70 ku外源蛋白,且该病毒携带~2.0 kb外源基因能稳定存活于寄主植物中;病毒TRVe2可用于分析蛋白质的生物学功能以及2个蛋白质间的相互作用。结论本文构建的重组病毒TRVe2为快速有效地表达2个外源蛋白以及分析2个蛋白质间的相互作用提供技术工具。

转H5禽流感病毒M2e基因烟草的研究

将禽流感病毒M2e与鸡IgG Fc的融合基因转入烟草植株,利用烟草生产禽流感抗原蛋白,探索利用植物作为生物反应器生产禽流感疫苗的可行性。将M2e-Fc融合基因克隆到植物表达载体pBI121中,与CaMV35s启动子相连,以烟草子叶作为外植体,利用农杆菌介导法将外源基因转入烟草中。对抗性植株进行了PCR、RT-PCR分析。结果表明,M2e基因已经导入到烟草中,在转录水平得到了表达。为进一步利用转基因植物生产禽流感疫苗进行了前期的探索工作。

慢病毒介导的RNA干扰抑制PAR2表达影响结肠癌细胞SW620增殖与迁移

目的构建人蛋白酶激活受体2(protease-activated receptor 2,PAR2)RNA干扰(RNAi)的重组慢病毒表达载体,探讨PAR2在结肠癌细胞SW620增殖与迁移中的作用。方法根据PAR2基因信息,设计4条PAR2 RNAi片段及1条阴性对照片段,western blotting筛选有效干扰片段,于293T细胞进行病毒包装,采用real-time PCR及western blotting检测干扰效率。PAR2激动剂(PAR2-AP)刺激感染后的SW620细胞,通过流式细胞仪、Transwell试验分别检测细胞周期及细胞迁移能力。结果构建的PAR2-RNAi慢病毒颗粒感染SW620细胞后,PAR2 mRNA及蛋白表达均被明显抑制。与对照相比,PAR2-AP不能促进感染后的SW620细胞增殖,细胞各周期比率未见明显差异,迁移试验结果显示穿膜细胞数也未见明显增多。结论成功构建的PAR2-RNAi慢病毒颗粒能显著抑制结肠癌细胞SW620的PAR2表达,进而阻断PAR2-AP对细胞增殖与迁移的促进效应,证明PAR2在SW620细胞增殖与迁移过程中发挥重要作用。

骨形成蛋白-2基因转染对辐射后成骨细胞增殖活性的影响

目的:探讨经过不同剂量X线照射成骨细胞后,感染复数(multiply of infection,MOI)值为100的腺病毒载体介导的骨形成蛋白-2(Ad-hBMP-2)基因转染对成骨细胞增殖能力的影响。方法:通过酶消化法,从Wistar大鼠乳鼠颅骨中获取成骨细胞并传代培养,分别进行0、100、300、500、700、900cGy的X线辐射。更换培养液后,加入Ad-hBMP-2进行转染。常规培养6d后,首先在倒置显微镜下观察不同辐射剂量条件下转染组与未转染组细胞的形态区别,采用MTT法检测各组细胞的增殖活力,并应用SPSS13.0统计软件包对数据进行t检验。结果:X射线剂量为100cGy时,细胞的增殖活性无明显变化;剂量增至300cGy时,细胞的增殖活性下降;转染Ad-hBMP-2后,增殖活性提高(P<0.05),经转染后细胞的增殖活性可提高至接近未接受放射线组细胞的水平;放射线剂量增至500cGy时,Ad-hBMP-2可以在一定程度上提高细胞的增殖活性(P<0.05);当剂量增至700cGy以上时,Ad-hBMP-2对细胞的增殖活性无显著影响(P>0.05)。结论:转染Ad-hBMP-2可以提高低剂量放射线照射后成骨样细胞的增殖能力,但在高剂量放射线条件下,细胞受到损伤,Ad-hBMP-2对细胞生长无影响,增殖能力无法恢复至正常水平。

转染三磷酸腺苷酶家族蛋白2 shRNA的人骨肉瘤细胞株U2-OS增殖、凋亡能力观察

目的观察转染三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)shRNA的骨肉瘤细胞株U2-OS增殖、凋亡的变化。方法以qRT-PCR法和Western blotting法分别检测人骨肉瘤细胞(U2-OS、MG-63、SaOS-2)和人正常成骨细胞(h FOB1.19)中ATAD2 mRNA、蛋白。在U2-OS细胞中转染ATAD2 shRNA慢病毒载体,采用qRT-PCR法和Western blotting法检测转染效果,CCK8方法检测细胞增殖变化,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成数目,碘化丙啶(PI)单染法检测细胞周期,膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/PI双染法检测细胞凋亡率,Western blotting法检测细胞剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(C-Caspase-3)、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK2)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(C-Caspase-9)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白。结果骨肉瘤细胞中ATAD2 mRNA、蛋白表达水平高于正常成骨细胞(P均<0.05)。ATAD2 shRNA慢病毒载体转染后的骨肉瘤细胞中ATAD2表达水平下降(P<0.05)。转染ATAD2 shRNA后的骨肉瘤细胞增殖能力和克隆形成能力均降低,细胞G1期比例升高,细胞凋亡率升高,细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达升高,CDK2、CyclinD1蛋白表达降低(P均<0.05)。结论转染ATAD2 shRNA可抑制U2-OS细胞增殖,并诱导细胞凋亡。

腺病毒载体介导人BMP-2与VEGF-165对骨髓间充质干细胞形态特征及增殖能力影响的实验研究

目的探讨携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)与血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)双基因的腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后对细胞形态特征及增殖能力的影响。方法选取4只新西兰大白兔抽取骨髓液,分离鉴定获得第3代BMSCs做为实验对象,实验分成4组:Ad-BMP-2-VEGF-165转染组(A组);Ad-BMP-2转染组(B组);AdVEGF-165转染组(C组);BMSCs对照组(D组),每组6个复孔,连测3次。首先,将腺病毒载体转染BMSCs,获得最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI);其次,转染后1-3d观察转染各组细胞与D组形态和贴壁状况差异变化;再次,ELISA法检测转染各组目的蛋白表达量与D组的差异;最后,MTT法测定1-7d各组细胞增殖曲线,并进行组间比较。结果 BMSCs分离鉴定成功,第3代细胞高表达CD29(99.82%),CD44(94.14%)抗原。腺病毒转染组最佳MOI值分别为A组MOI=80,B组MOI=80,C组MOI=100。腺病毒转染后各组细胞形态和贴壁特性未见明显改变,边界清晰,细胞呈梭形,细胞核较大呈圆形或椭圆形,生长旺盛。转染组细胞高表达目的蛋白,在第5d目的蛋白浓度到高峰,A组BMP-2浓度为1525.47±58.16pg/ml,B组为1506.48±92.65pg/ml;A组VEGF-165浓度为1732.14±126.25pg/ml,C组为1733.59±127.07pg/ml,转染组在不同时间点的目的蛋白表达量与D组差异均具有统计学意义(P<0.05)。MTT法显示第1d、第2dBMSCs未见明显增长,第3d开始呈指数增长,第5d达高峰;第3d,A组、B组吸光度(optical density,OD)值分别为0.113±0.004、0.112±0.003,均高于C组、D组(P<0.05);第4d,A、B、C各组OD值分别为0.113±0.004、0.110±0.003、0.105±0.001,均高于D组0.102±0.004,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP-2与VEGF-165对BMSCs形态和贴壁性无明显影响,但是均可以促进BMSCs增殖,且两者对细胞的增殖无明显叠加作用。

慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子,利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具有重要意义。目的:探讨慢病毒介导人BMP-2和人VEGF-165双基因转染(2次转染)骨髓间充质干细胞的可行性以及转染后细胞的诱导成骨性能。方法:将骨髓间充质干细胞分为4组:(1)未转染组;(2)空载组:通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞;(3)BMP-2组:转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP);(4)BMP-2/VEGF-165组:通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP,Lv-VEGH-165/RFP)。转染后不同时间点Western Blot检测目的蛋白表达,MTT法检测各组细胞增殖活性,转染后14 d检测各组细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论:(1)空载组、BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组在荧光显微镜下均可见相应的绿色及红色荧光蛋白表达;(2)转染后3 d,BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组均有相应目的蛋白高表达;转染后7,14,21 d,目的蛋白检测无明显变化(P>0.05);(3)BMP-2/VEGF-165组增殖稍快于BMP-2组(P<0.05),BMP-2组明显快于未转染组、空载组(P<0.05);(4)BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶活力明显高于未转染组、空载组;(5)结果表明,慢病毒介导的h BMP-2和h VEGF-165双基因经2次转染成功转入兔骨髓间充质干细胞内,并长期稳定表达,该双因子的表达能通过刺激细胞碱性磷酸酶生成促使细胞更好的向成骨细胞分化。