采用TEV酶法进行整合膜蛋白拓扑学分析

为了研究膜蛋白的跨膜结构,进行拓扑学分析是十分重要的.有许多分析膜蛋白拓扑结构的方法,本文采用烟草蚀斑病毒(TEV)酶特异性切割测试蛋白中跨膜片段的前段或后端所插入的tev识别序列EXXYXQ(S/G),如果TEV酶能够切割,表明该序列位于目标蛋白的细胞质外.将Tev识别序列ENLYFQG分别插入到拟南芥整合膜蛋白的的跨膜区域,然后转化进入酿酒酵母中.消解酶(zymolyase)酶破除酵母的细胞壁后,TEV酶消化球状体,最后通过Western免疫印迹法来分析结果.有关该方法的注意事项在结果中进行了讨论.

一种新的产生天然蛋白的不依赖于连接的克隆载体

报道一种新的不依赖于连接的克隆(LIC)载体.该载体被缺刻的内切酶N.BbvCIA和限制性内切酶SwaⅠ作用产生长的粘性末端.靶向基因的PCR片段在4 mmol/L dGTP的孵育下被T4 DNA聚合酶处理生成互补粘性末端.将处理过的载体和PCR产物共转化到大肠杆菌体内,插入载体的接合能够被宿主酶和给定的重组质粒修复.接着引入到大肠杆菌表达系统,该融合蛋白能够被表达和纯化,再用烟草蚀刻病毒TEV蛋白酶处理将移去靶蛋白的N末端,产生天然蛋白.两个基因,绿色荧光蛋白基因egfp和硫氧环蛋白基因txn已被用于这个系统.结果表明LIC策略对于高通量克隆和表达是高效的,对于天然蛋白的产生也同样高效.